2020年，中国新发癌症患者457万，而目前对于癌症患者常用的治疗手段会导致女性卵巢早衰，具估计中国每年需要生育力保护或生育力保存的女性患者超过200万[1]。过去的几十年里生育力保存技术取得了巨大的发展，给患者带来更多选择和希望。生育力保存新技术——卵巢组织冷冻，不受年龄和婚姻状况的限制，还可以储存大量的对冷冻保存具有更好耐受性的原始卵泡，这为未来可受精卵母细胞的来源提供了可能。因此在女性生育力保存方面，卵巢组织冷冻更具有优势。卵巢组织冷冻主要包括慢速冷冻和玻璃化冷冻两种方式，尽管绝大多数研究均使用慢速冷冻作为卵巢组织冷冻保存的成功方法，但也有报道在绵羊[2]和人类[3]中使用玻璃化冷冻成功分娩。有研究[4]表明玻璃化冷冻技术是一项有效的卵巢组织冷冻技术，玻璃化快速简便，不需要昂贵设备，并且可以防止形成冰晶对样品造成损伤。然而随着对玻璃化冻存逐步深入的研究，仍有许多待完善的细节。玻璃化过程需要快速的冷却速率和高浓度的低温保护剂，这两个因素在玻璃化样品上会诱导高水平的氧化应激，从而改变组织超微结构和形态，损害细胞活力，而这些破坏性影响可以通过在玻璃化溶液中添加合适的抗氧化剂来最小化[5]。本文将综述抗氧化剂在卵巢组织玻璃化冷冻保存中的研究进展，内容包括氧化应激产生及对卵巢组织的影响，在卵巢组织玻璃化中常用的抗氧化剂。

1、氧化应激对卵巢功能的影响

1.1线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)和活性氧(ROS)产生

线粒体是细胞内进行氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，其内膜上的ATP合酶和呼吸链为线粒体OXPHOS进行能量转换提供必要保障。呼吸链由4种含有电子载体的复合物(复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ)和2种独立存在于膜上的电子载体(泛醌和细胞色素C)组成。电子传递过程首先由三羧酸循环将还原型辅酶Ⅰ(NADH)和还原黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)分别供给2种跨膜蛋白，即呼吸链复合物Ⅰ和复合物Ⅱ,分别催化电子传递到泛醌，然后进一步传递给复合物Ⅲ,再由细胞色素C传递给复合物Ⅳ;最后传递给O2,生成H2O。在电子传递过程中，高能电子的能量逐级释放，而基质中的质子则借助高能电子释放的能量被不断的定向转运到膜间隙，导致跨内膜的电荷和质子梯度累积，称为电动势，其作用类似于存储电化学物质的电池能源。ATP合酶位于电子传递链末端，其利用电动势将无机磷酸基团连接到二磷酸腺苷(ADP)上并生成ATP,整个过程称为OXPHOS。一部分ATP随后被线粒体利用，其余的则以化学能的形式释放到细胞质中，用于各种细胞过程。线粒体中的呼吸链是一个非常有效的系统，线粒体通过氧化磷酸化产生细胞的大部分能量同时也产生了副产物ROS。据估计，每日线粒体总耗氧量的1%～2%用于ROS的产生，而复合物Ⅰ和复合物Ⅲ被认为是产生ROS的主要位点，氧在电子传递链复合体Ⅰ和Ⅲ反应中因高氧环境和高还原态使大量电子漏出并还原氧分子而形成，生成超氧阴离子自由基、羟基自由基及过氧化氢(H2O2)等ROS[6]。

1.2卵巢组织玻璃化冷冻保存下氧化应激的产生

机体和细胞内部存在内源性的抗氧化体系，主要包括ROS清除剂和抗氧化物酶：谷胱甘肽(GSH)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)及谷胱甘肽巯基转移酶(GST)等。在正常情况下，其能清除掉细胞活动过程中产生大部分的ROS,即细胞内的ROS与内源性的抗氧化体系形成动态平衡。ROS作为重要的信号分子，参与许多细胞适应机制，因此ROS的生理水平是有益的。但在玻璃化冷冻过程中，ROS会不断产生，过量囤积，最终引起氧化和抗氧化失衡的氧化应激状态。一方面卵巢组织在冷冻和复温过程中，会引起ATP耗竭和酶活性降低[7]。另一方面，高浓度低温保护剂本身的毒性及其引起的渗透压，可能导致细胞膜损伤，线粒体功能损伤等组织的超微结构损伤，而功能障碍的线粒体又会引起更多的ROS产生[8]。

1.3冷冻保存中氧化应激对卵巢组织的损伤

低温保存与卵巢组织损伤有关，并导致卵泡凋亡和基质细胞损伤发生，表现为基质细胞溶解、核固缩、核溶解、细胞质空泡化及组织萎缩。卵巢组织低温保存中，保持生殖细胞的完整性是关键，然而在氧化应激状态下，细胞产生应激反应，导致内皮损伤，微血管通透性和组织肿胀，通过激活黏性分子和促进细胞因子产生，启动炎性反应，启动细胞内凋亡或坏死信号，通过缺氧和增加细胞内Ca2+离子浓度与细胞内核受体结合，触发细胞内凋亡信号的释放[9]。另外，过量ROS可以使金属蛋白酶(MMPs)的表达失调，MMPs是一个重要的酶家族，当表达异常升高时会破坏细胞外间质的成分，如胶原蛋白、纤维连接蛋白及层粘连蛋白，从而导致细胞外间质的成分流失。此外，积聚的ROS会损伤DNA,而基质降解另一个原因也可能是编码这种结构的组成部分的基因中DNA碱基逐渐损坏而发生。这些作用共同控制细胞衰老、细胞凋亡及改变细胞信号传导，从而损害冻存组织的活力[10]。氧化应激导致冻存质量下降是卵巢组织玻璃化常见的原因，这表明在卵巢组织冻存方案方面仍有改进的余地。

2、卵巢组织玻璃化添加抗氧化剂的作用

近年来，国内外研究团队就冷冻方案和冷冻保护剂对卵巢组织的潜在毒性进行了诸多研究，研究方案主要通过添加抗氧化成分和细胞外基质成分，来尽可能地保存卵泡和间质成分和活力。尽管不同研究团队报道的结果存在较大差别，但总体来说大多数抗氧化剂添加后对冻存的卵巢组织显示出抗氧化、提高抗氧化物酶水平及保护细胞外基质的作用。以下将综述几类有较多研究的抗氧化剂，主要有植物性提取物抗氧化剂(白藜芦醇、芦荟提取物)、酶类抗氧化剂[α-硫辛酸(ALA)、辅酶Q10(CoQ10)]及其他抗氧化剂[褪黑素(MLT)]等。

2.1植物性提取物抗氧化剂

2.1.1白藜芦醇

白藜芦醇是一类具有显著药用价值的天然化合物，具有多种生物活性，例如抗癌、抗氧化、抗炎及保护心血管系统，抗肥胖和生殖障碍(与衰老相关的不孕症和多囊卵巢综合征)[11]。白藜芦醇可以保护细胞膜，并减少由氧化应激和冷冻保存过程引起的脂质过氧化的有害作用，降低细胞损伤[12]。在卵巢组织玻璃化/解冻过程中，卵泡和卵母细胞直径变小被认为可能是一种保护卵母细胞的防御机制，而在使用了添加有白藜芦醇的冷冻保护剂后也有类似发现即相比于冷冻对照组具有较小直径的卵泡和卵母细胞，这表明白藜芦醇可能在这个过程中产生有利的条件，例如：①在细胞代谢重建时解冻过程中水和溶质的平衡流入；②保存负责水和冷冻保护剂运输的跨膜蛋白通道(水通道蛋白) [13]。除此，白藜芦醇处理玻璃化冻融后的猪卵母细胞时发现其可以激活与线粒体合成相关的基因，增加线粒体蛋白质含量和DNA拷贝数，并改善卵母细胞的存活率[14]。有研究[15]表明卵巢组织低温保存和移植可以改善生育能力的保存和恢复，但是在移植过程中早期缺血再灌注损伤、自由基及氧化损伤可引起卵母细胞和膜脂质损伤或凋亡，增加微血管通透性和卵巢组织肿胀，并通过激活粘附分子和增强细胞因子的产生激活炎症反应。而Wang等[12]通过自体移植冻融小鼠卵巢组织，在移植后3 d、7 d及21 d取回卵巢移植物，发现服用45 mg/kg白藜芦醇治疗后的小鼠具有更好的卵巢组织移植质量和胚胎结局，表明白藜芦醇可以通过抗炎和抗氧化机制提高冷冻解冻小鼠卵巢组织自体移植的疗效。

2.1.2芦荟提取物

芦荟的固体含量具有超过75种不同的潜在活性化合物，包括矿物质、酶、水、脂溶性维生素、简单和复杂的多糖、酚类化合物及有机酸，因此其具有多种药理学特性，包括抗氧化活性。添加芦荟提取物可降低CAT的表达，提高抗氧化物酶PRDX6、GPX1及SOD mRNA水平，改善体外培养冻融卵巢组织卵泡生长和存活率[10]。细胞外基质是由细胞分泌，分布于细胞外的蛋白质和多糖等大分子构成的网络结构，包括胶原、非胶原糖蛋白、氨基葡聚糖与蛋白多糖、弹力蛋白等4大类，从而使组织的物理结构稳定。细胞外基质结构的稳定可以通过微环境来调节细胞活性和发育[16],包括细胞增殖和存活，类固醇生成，调节细胞聚集和形态。因此，维持基质的完整性对卵巢组织深低温保存后的卵泡存活至关重要。在氧化应激的情况下，积聚的ROS具有降解细胞外间质成分作用，破坏细胞外基质的完整性，然而添加芦荟提取物显示出保护细胞外基质完整性的作用，维持胶原纤维比例，进而改善了牛卵巢组织玻璃化后的卵泡形态和细胞活力[10],这一作用可能是芦荟提取物对金属蛋白酶的作用，在之前也有报道[17]显示芦荟能够抑制小鼠组织中MMP-9的mRNA水平。

2.2酶类抗氧化剂

2.2.1 ALA

ALA被认为是丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶复合物活性的重要辅助因子，在线粒体脱氢酶反应中起着至关重要的作用。ALA可以通过再生内源性抗氧化剂增加细胞内谷胱甘肽水平，直接或间接消除ROS,抑制TNF-α和6-羟基多巴胺诱导的ROS生成及螯合金属离子发挥抗氧化作用[18]。在几项体外培养实验中加入ALA后，发现ALA能维持马卵巢组织正常卵泡百分比[19]、提高小鼠窦前卵泡总抗氧化能力，降低ROS水平[20]及改善牛次级卵泡发育和生长[21]。对于改善体外成熟条件提高体外培养冻融卵巢组织的窦前卵泡存活率和发育能力，除了ALA的抗氧化作用外，另一种解释是可能与抑制细胞死亡、金属螯合及抗氧化剂再循环有关[20]。此结果与Hatami等[22]研究结果相似，ALA的预处理使窦前卵泡体外发育的存活率、MⅡ卵母细胞、受精率、胚胎及囊胚发育率提高。另外在体外培养7 d或异种移植15 d向绵羊卵巢组织玻璃化溶液中加入ALA能够更好地保持基质细胞密度，有利于颗粒细胞增殖和新生血管形成[5]。

2.2.2 CoQ10

CoQ10是一种脂溶性生物活性醌，并具有多种生物学和生理功能，如参与调控细胞氧化还原状态、线粒体膜内外质子梯度形成及帮助调控膜结构和磷脂状态等[23]。上述所有功能中，最重要的作用是其共存的氧化还原形式(泛醌，半泛醌及泛醌)的有效抗氧化能力，其抗氧化特性一方面在线粒体电子传递链中提高了电子传输的效率，减少电子泄漏，另一方面可以直接作用于自由基或氧化剂，减少和中和化合物，保护细胞膜免受脂质过氧化侵害。值得注意的是CoQ10在发挥抗氧化作用的同时，其在氧代谢过程中生成的超氧阴离子自由基是氧代谢的主要ROS类之一，因此CoQ10作为促氧化剂和抗氧化剂的双重性质使其成为细胞中氧化状态平衡的关键调节元件。有研究[24]发现，在排卵前补充CoQ10可改善老年小鼠的线粒体功能，并改善小鼠非衰老相关线粒体功能障碍[25]。因此，CoQ10水平不足可能引起线粒体呼吸活性降低，导致ATP产量降低，ROS消除减少，氧化应激增加，线粒体损伤和随后的线粒体功能障碍。此外，在培养基中补充CoQ10也恢复了因年龄引起的小鼠卵母细胞质量恶化[26]。最后，注射到老年小鼠体内的CoQ10增加了卵丘细胞的线粒体呼吸活性和葡萄糖摄取及每个卵母细胞的卵丘细胞数量，最终提高生殖能力[27]。表明补充CoQ10不仅可以使卵母细胞受益，而且可以使卵丘细胞受益。在卵巢组织玻璃化冷冻中，补充CoQ10可以促进GPX、SOD及CAT活性，表明CoQ10在保护窦前卵泡免受氧化损伤方面的关键作用。此外，在培养的来自冻融卵巢组织的窦前卵泡中，MDA随着GPX、SOD及CAT活性的增加而显著降低，可能的原因是CoQ10增加SOD、GPX及CAT活性，导致H2O2和MDA水平降低，改善线粒体功能，提高卵泡质量[28]。

2.3其他抗氧化剂

2.3.1 MLT

MLT是由松果体分泌的吲哚胺类物质，在调节昼夜节律、免疫应答、炎症及肿瘤发生等方面发挥多种生物学功能[29]。MLT的抗氧化作用比维生素C或E更有效，首先，其是一种亲水性和亲脂性分子，容易扩散到各种亚细胞区室，如细胞质、细胞核及线粒体[30];其次，其可以间接加速线粒体呼吸链的电子传输速度，减少电子泄漏，减少ROS形成；最后，其代谢物在清除有毒的氧基和氮基反应物方面与母体分子效果相当[30]。Liu等[31]在小鼠卵巢组织玻璃化冷冻中添加MLT发现其可以清除自由基，避免ROS过度累积使脂质过氧化、蛋白质破坏及核DNA损伤，还能提高SOD、GSH、CAT及GSH-Px等抗氧化酶水平，增强抗氧化能力。MLT还可以通过调节抗氧化相关通路，促进Nrf2 mRNA的表达，从而诱导抗氧化酶的活化来实现抗氧化功能[32]。目前，在卵巢中发现有两种褪黑激素特异性受体(MT1和MT2),其作用于卵巢，调节类固醇生成，从而增加孕酮及其受体的合成，其还调节黄体的形成，表明MLT具有改善排卵功能的作用[33]。另外，通过对接受卵巢移植的动物的组间对比发现，MLT组的正常发情周期恢复更快，雌激素受体表达显著高于对照组。表明MLT可以为排卵和荷尔蒙活动的恢复提供更好的条件[33]。

然而，在冷冻保护剂中加入抗氧化剂并不总是能起到改善效果。己酮可可碱(PTX)是一种甲基黄嘌呤衍生物，可以减少ROS,PTX已被用作抗氧化剂，在多囊卵巢综合征诱导的大鼠模型中可以减少卵泡闭锁[34]。但有研究[35]表明，其不能预防和恢复玻璃化作用破坏的小鼠卵巢组织学和超微结构，对卵巢玻璃化组织也没有足够的保护作用。维生素C和E通常可以减少人类和金头鲷精子的DNA损伤，但这些抗氧化剂却增加了冷冻保存欧洲鲈鱼精子的DNA损伤[36]。槲皮素在低浓度时可以发挥保护作用，当高于10μmol时，会产生细胞毒性作用诱导细胞凋亡[37]。此外，高浓度的抗氧化剂将细胞从氧化应激转化为还原应激，这也可能对细胞的结构和功能产生负面影响。因此，在冷冻保存之前，考虑物种、细胞类型、质量及细胞完整性，在冷冻保存介质中补充特定浓度的抗氧化剂非常关键。

综上所述，卵巢组织冷冻技术作为青春期前女性生育力保存的唯一方法，在将来应用会越来越广泛。玻璃化诱导的ROS过量产生引起线粒体功能损伤，严重影响细胞的结构和功能，甚至引起细胞凋亡。抗氧化剂作用机制多种多样，但其通常增强线粒体功能或直接清除自由基，这反过来又保护其他细胞成分免受氧化应激。本综述中描述的大多数研究添加抗氧化剂均显示出正面效果，但少部分并不表现出预期改善效果，特别是当使用的抗氧化剂浓度相对较高时，需要根据实际情况探索使用恰当的抗氧化剂，才会有好的效果。此外还有许多天然的和合成的抗氧化剂在低温保存方面可能存在潜力，但尚未被使用。随着低温冷冻技术研究的深入和实验方法的进步，抗氧化剂有望在卵巢组织玻璃化冷冻中发挥重要作用，以期为女性患者带来福音。

参考文献:

[1]谷牧青,Pooja D,阮祥燕.女性生育力保护/保存进展[J].实用妇产科杂志,2021,37 (10):721-723.

[9]李扬璐,阮祥燕,程姣姣,等.抗氧化剂联合应用优化人卵巢组织冻融效果的研究[J].首都医科大学学报,2021,42 (4):526-532.

[29]郭路,李斌.氧化应激影响早发性卵巢功能不全的作用机制及干预策略[J].老年医学与保健,2021,27 (6):1323-1325.

[37]杨璐恺.槲皮素在羊卵巢组织玻璃化冻存中的卵泡保护及抗氧化作用[D].济南:山东大学,2020.

基金资助:广西壮族自治区南宁市江南区计划项目(20220620-8);广西壮族自治区南宁市良庆区科学研究与技术重点研发计划(202009);

文章来源:姚兴凤,陆清芳,许常龙.抗氧化剂在卵巢组织玻璃化冷冻保存中的研究进展[J].中国妇幼保健,2024,39(05):958-961.