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GABRG2基因3'端的多态性分布及法医学应用价值

2020-07-31 391 上传者：管理员

摘要：目的：调查GABRG2基因5个SNPs在中国北方汉族群体的多态性分布，评价其法医学应用价值。方法：采用PCR扩增结合Sanger测序技术对213例中国北方汉族健康无关个体样品进行检测，应用Haploview4.2进行数据的统计分析。结果：检测到rs418210、rs424740、rs34705786、rs401750和rs647625等5个SNPs,其基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，个人识别几率分别为0.632、0.613、0.631、0.634和0.623，非父排除率分别为0.187、0.179、0.178、0.187和0.187。结论：GABRG2基因5个SNPs在中国北方汉族人群中具有较好的遗传多态性，可用于法医学个人识别与亲权鉴定。

关键词：
GABRG2
SNPs
北方汉族
多态性
法医学
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单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNPs）是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的发生频率大于1%。SNP是近年来的研究热点之一，具有在人类基因组中分布广泛、蕴藏信息丰富、待分析片段短、易于分析、突变率低等优势[1]。SNPs是继DNA指纹图、微卫星之后的第三代遗传标记，大约每1000bp会出现一个SNPs，人类基因组中约存在300万个SNPs，其数量要比STR基因座超出几个数量级。相较于STR,SNPs的扩增片段可小于100bp，意味着因DNA降解无法满足STR检测时，SNPs仍可提供样品的遗传学信息。但是由于SNPs的二等位基因的性质，多态性程度远低于STR。因此，只有检测相当数量的SNPs，才能获得与多等位基因STR标记相当的识别率。同时，作为遗传标记在应用于法医学实践时必须具有特定群体或地域法医学;多态性;SNPs;GABRG2;北方汉族的多态性分布数据与相关参数。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid,GABA）是中枢神经系统中的主要抑制性神经递质。GABRG2(gamma-aminobutyricacidtypeAreceptorgamma2subunit）基因负责编码GABA受体。该受体通过与GABA结合在大脑中发挥快速突触抑制作用。GABA有GABAA和GABAB两类受体。GABAA受体（GABAARs）有19种不同的亚基，包括α1～6、β1～3、γ1～3、δ、ε、π和ρ1～3。GABRG2基因编码γ2亚基，其位于5q34，全长94898bp,包含11个外显子。本研究拟通过测序的方法检测GABRG2基因3'端DNA片段中的SNPs及在中国北方汉族群体的分布并探讨其法医学应用的价值。

1、材料和方法

1.1 实验样品

213例中国北方汉族无血缘关系个体血液样品，由中国医科大学法医学院提供。所有参与者均签署知情同意书。

1.2 PCR扩增

根据NCBI数据库中人的GABRG2基因序列，用Primer5软件设计引物，上游引物序列：5'-AGCCTAGTCCAGAAATCTATTACAC-3'；下游引物序列：5'-GGAGGAATGCTTTAGCTCAGAAGTT-3'，引物由金唯智生物科技有限公司（中国）合成。扩增片段为GABRG2基因3'端91191bp～93358bp区域，长度为2168bp。

PCR反应体系为20μl，其中包括DNA模板2μl（约10ng），上下游引物各1.5μl(7.5pmol),LA-taqDNA聚合酶（Takara)1U,10×buffer2μl,dNTP2μl，去离子水10.8μl。

PCR反应条件为：94℃预变性5min后，接着是30个循环94℃变性30S,57℃退火30S,72℃延伸90s，最后72℃再延伸7min。

1.3 PCR产物的序列分析

PCR扩增产物由沈阳莱博睿生物科技开发有限公司（中国）采用Sanger测序法进行测序检测。所使用的测序引物中，上游引物序列为：5'-AGCCTAGTCCAGAAATCTATTACAC-3'；下游引物序列：5'-GGAGGAATGCTTTAGCTCAGAAGTT-3'。

1.4 数据的统计分析

利用Chromas2.23和DNAman8.0软件对测序结果进行分析。直接计数法计算基因型频率和等位基因频率。应用Haploviewv4.2软件进行HardyWeinberg平衡检验和连锁不平衡分析。

2、结果

2.1 SNPs及分型

根据测序图谱共探究到rs418210(91336G/T）、rs424740(91388T/A）、rs34705786(92847-92848del）、rs401750(93014C/T）和rs647625(93130G/A）等5个SNPs（如图1所示），未发现新的碱基突变。

2.2 SNPs的多态性分布

5个SNPs均分别检测到两种等位基因及3种基因型，其基因型和等位基因频率见表1。5个SNPs位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（p值>0.05）。

表15个SNPs在中国北方汉族群体中的分布

2.3 SNPs的法医学参数

根据5个SNPs位点在中国北方汉族群体的遗传多态性分布数据，计算各位点的法医学参数见表2。5个SNPs位点的个人识别几率在0.613～0.634之间，非父排除率在0.178～0.187之间。

表25个SNPs位点在中国北方汉族群体中的法医学参数

2.4 单倍型与连锁关系分析

5个SNPs位点之间连锁不平衡系数D'在0.95～1.0之间，呈现紧密连锁。5个SNPs位点可构成TAdTA、CTiCG、CAiCA、TAiTA、CAiTG、TAiCG、CAiTA、CAdCG及CAdTA等9种单倍型。其中频率大于1%的单倍型有TAdTA、CTiCG、CAiCA、TAiTA、CAiTG等5种，并检测出了15种基因型组合（表3）。其中CT-AT-di-CT-AG的频率最高，为0.305;CT-AA-ii-TT-AG等4个基因型组合频率最低，为0.005。

图1五个SNPs位点的测序图谱

3、讨论

SNPs作为遗传标记应用于法医学实践必须具有不同民族或地域的群体遗传学数据。本研究检测了中国北方汉族个体GABRG2基因3'端DNA片段中的rs418210、rs424740、rs34705786、rs401750和rs647625等5个位点，并提供了其多态性分布数据与相关的法医学参数。结果表明，这5个位点均具有较好的遗传多态性，其多态性分布符合Hardy-Weinberg平衡（p>0.05），个人识别几率在0.613～0.634之间，非父排除率在0.178～0.187之间。说明上述5个SNPs位点是较好的法医学个人识别与亲权鉴定备选的遗传标记。

单倍型（haplotype）是指在一条染色体或线粒体上，紧密连锁的多个等位基因的线性组合，每一种组合方式即为一种单倍型[2]。更进一步地讲，单倍型是具有统计学关联性的遗传标记，可由多个SNP位点构成，包含丰富的遗传信息，研究单倍型比单个SNP位点具有更好的分析效果[3]。本研究共观测到9种单倍型及15种基因型组合，频率较高的3种单倍型使得其鉴别能力进一步提高（表4）。近年，微单倍型（microhaplotype）的概念被提出来。美国耶鲁大学Kidd教授研究团队在前期单倍型相关研究基础上，从长度小于10KB的区域内选取位置相对靠近的SNP，并避开易发生重组的位点，最终筛选出8个迷你单倍型基因座（mini-haplotype）。通过对45个群体进行检测，结果显示筛选的8个迷你单倍型基因座的高杂合度及群体分布差异性能够提供亲权鉴定及种族推断需要的相关信息[4]。为了进一步筛选更适合法医学应用的单倍型基因座，Kidd教授团队于2013年首次将微单倍型遗传标记引入法庭科学领域。相较于迷你单倍型，微单倍型的片段长度更短，其定义是在200bp范围内2～5个SNP的组合[5]。由于微单倍型基因座内含有多个SNP位点，所以微单倍型是多等位基因遗传标记，包含更加丰富的遗传信息[6]。微单倍型作为一种新型的遗传标记正逐渐展现出其在法医遗传学领域独特的优势，越来越多的研究团队正在关注微单倍型遗传标记。

表35个SNPs组成的单倍型及在中国北方汉族群体中的频率

本研究检测的5个SNPs在国内还没有相关报道，我们将由NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）检索到的GABRG2基因的rs418210、rs424740、rs34705786、rs401750和rs647625等5个位点在欧洲白人、非洲黑人和美国白人群体的多态性数据并与本研究获得的数据进行比较（表5、表6）。中国北方汉族群体与其他3个群体在某些SNP位点中的分布具有显著性差异。

表43个主要单倍型在中国北方汉族群体中的法医学参数

GABA是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，通过与其受体结合，可导致大脑兴奋和抑制信号之间平衡失调[7]。已有研究表明GABA受体的mRNA和蛋白质的异常表达，对正常认知、情绪和知觉的维持产生潜在而深远的影响[8]。有研究提示GABAA受体基因与癫痫综合征具有关系[9]，本研究检测到的rs401750位点属于与癫痫相关的风险基因之一[10]，其相关研究可能为原发性或继发性（外伤性）癫痫鉴别的法医学鉴定提供参考指标。GABAA受体基因簇（包括GABRB2、GABRA6、GABRA1和GABRG2）是关于精神分裂症易感性分析中最有吸引力的候选基因簇之一[11]。Ishikawa等证明了GABAA受体的γ亚基在精神分裂症和双相情感障碍患者的前额叶皮质中是存在差异的[10]。也有学者证实在高加索人群中GABRG2基因5’区域的rs183294与精神分裂症相关联，其中C等位基因在这些病例中过度表达[12]。因此，关于GABRG2与精神分裂症的关联性研究在法医精神病学研究中可能具有重要的意义。

表55个SNPs位点在不同人群中等位基因频率的分布

表65个SNPs位点的遗传多态性的群体间比较

参考文献：

[1]侯光伟,刘利民,姜先华,等.常染色体21个SNPs多态性分型方法研究[J].中国法医学杂志,2010,25(4):249-252.

雍梦馨,邢佳鑫,丁梅,赵梦阳,吴军胜,姚军,宣金锋,夏皙,庞灏,王保捷.GABRG2基因3'端的遗传多态性及法医学意义[J].中国法医学杂志,2020,35(03):269-273.