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PSA荧光探针在FRET基础上的制备及法医学应用

2020-08-01 222 上传者：管理员

摘要：目的：设计合成靶向识别检测前列腺特异性抗原的有机小分子荧光探针，探索荧光探针在生物物证精液斑确证试验上的应用。方法：基于荧光共振能量转移机理设计合成前列腺特异性抗原荧光探针，通过质谱、高效液相色谱法等对探针进行结构及纯度表征分析，采用荧光光谱法测试探针对前列腺特异性抗原的荧光响应，制作不同附着物的精液样品检材，利用倒置荧光显微镜观察记录荧光成像。结果：成功设计合成了一种前列腺特异性抗原荧光探针，荧光光谱实验表明其对前列腺特异性抗原有较好响应，最低检测限为0.8μg/mL，不同附着物精液检材荧光成像实验进一步验证了荧光探针在精液斑确证试验上的应用。结论：本研究设计合成了一种对前列腺特异性抗原响应灵敏的荧光探针，有望用于法医学领域精液斑的确证试验。

关键词：
前列腺特异性抗原
精斑检测
荧光共振能量转移
荧光成像
荧光探针
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前列腺特异性抗原（prostatespecificantigen,PSA）是由前列腺腺泡和导管的上皮细胞分泌的一种单链糖蛋白，参与精液的液化过程。前列腺特异性抗原具有极高器官特异性和种属特异性，被用于法医物证学精斑确证试验，是可以替代精子显微镜检查的最常用的确证方法，特别适用于无精症精液斑鉴定[1,2]。另外，临床常规用于前列腺良性与恶性疾病鉴别诊断，以及前列腺癌患者术后随访的重要指标[3]。前列腺特异性抗原的检测方法通常包括酶联免疫吸附法，表面等离子共振、电化学发光、电化学免疫分析、胶体金法和荧光法等，但部分检测方法存在成本高、检测条件苛刻等局限性而限制了其实际应用。利用靶向肽序列识别检测特定蛋白质具有低成本、易合成、稳定性好、安全可靠和适应性好等优点逐渐地被开发和应用[4]。有机小分子荧光探针能够特异性检测某些标志物，在检测方面正在发挥着重要作用[5]。已有数篇文献报道利用PSA对特定肽序列（HSSKLQ）具有识别水解特性，设计基于靶向肽序列的不同荧光探针对PSA进行特异性检测[6,7]。

荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）方法具有高灵敏度和高分辨率，且对检材样品的活性及空间构像影响小，被广泛开发应用于离子、有机小分子以及蛋白质的定量定位分析[8]。本研究基于荧光共振能量转移机理（FRET），将荧光基团与淬灭基团通过特定肽序列连接，制备一种前列腺特异性抗原荧光探针（DabcylGGHSSKLQLAAAK-FAM），实现对前列腺特异性抗原的识别检测。

1、材料和方法

1.1 仪器和试剂

质谱数据采用Agilent-6125B质谱仪进行测定，高效液相色谱采用创新通恒LC3000半制备液相色谱仪测定，荧光数据采用EdinburghInstrumentsFS-5荧光分光光度计进行测定，荧光成像实验通过LeicaDMi8倒置荧光显微镜进行测定。

前列腺特异性抗原购于abcam，前列腺特异性抗原探针纯品由吉尔生化（上海）有限公司制备，PBS缓冲液购于博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制方法

前列腺特异性抗原荧光探针用PBS缓冲液溶解，制备成浓度为1mM的探针储备液，用前稀释成10μM测试溶液。前列腺特异性抗原用PBS溶液配制成浓度为1mg/mL储备液，用前稀释。

1.2.2 光谱测试方法

每次用微量注射器将前列腺特异性抗原加入含有3mL探针测试溶液的1cm宽的比色皿中，激发波长为488nm，激发和发射光谱狭缝宽均为0.8nm，进行荧光光谱测试。

1.2.3 荧光成像实验样品制备方法

样品组：取0.4μL精液分别滴于玻璃、纸、乳胶，再分别混合10μM的荧光探针0.6μL。对照组：取0.4μLPBS溶液分别滴于玻璃、纸、乳胶，再分别混合10μM的荧光探针0.6μL，静置1min后进行观察拍照。

1.2.4 荧光探针的构建

前列腺特异性抗原靶向荧光探针委托吉尔生化（上海）有限公司合成。合成的探针通过基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱和高效液相色谱法（high-pressureliquidchromatography）表征。MALDI-TOF-MS:470.3,[M+4H]4+;626.7,[M+3H]3+;939.3,[M+2H]2+。HPLC保留时间：13.690min，详细技术参数见表1。

表1高效液相色谱（HPLC）技术参数

2、结果

2.1 荧光光谱实验

采用荧光光谱实验对不同浓PSA进行了测定。结果表明，荧光探针在识别检测PSA过程中，荧光增强速率和强度与PSA浓度呈正相关（图1），且荧光强度与PSA浓度之间呈现良好的线性关系（图2）。最低检测限为0.8μg/mL，远低于正常人精液中前列腺特异性抗原浓度0.5～3.0mg/mL。

2.2 荧光成像实验

为了进一步验证探针的实际应用价值，利用荧光探针对不同附着物上的精液样品进行了荧光成像实验（图3）。采用LeicaDMi8倒置荧光显微镜，蓝光激发，10×5倍镜下观察并记录其荧光成像，可见含有前列腺特异性抗原的精液样品组呈现强烈的黄绿色荧光，对照组无荧光。

图1在525nm处，不同浓度前列腺特异性抗原存在下荧光探针（10μM）荧光强度随时间（30min）变化的函数图

图2探针荧光强度与前列腺特异性抗原浓度Benesi-Hildebrand线性拟合图，S=0.0621，δ=0.01662,K=3,LOD=K×δ/S=0.8μg/mL

图3荧光探针对不同附着物上的精液样品中的前列腺特异性抗原检测的荧光成像图，精液样品组：（a）玻璃，（b）纸，（c）乳胶；对照组：（d）玻璃，（e）纸，（f）乳胶

3、讨论

前列腺特异性抗原具有极高的组织器官特异性以及种属特异性，被认为是目前诊断前列腺癌最有价值的肿瘤标志物，也被用于精斑确证试验。荧光检测法因具有高选择性、快速灵敏、对检测样品损伤小以及能够实现实时成像的特点而广泛被用于蛋白质的检测研究。特别是能被前列腺特异性抗原特异性识别和酶切的靶肽序列HSSKLQ[6]被发现以来，基于靶肽识别的荧光探针被开发用于前列腺特异性抗原的识别检测。JamesGooch等[9,10]先后基于该肽序列HSSKLQ分别与荧光基团香豆素、罗丹明连接，制备出有机小分子荧光探针，验证了探针对PSA的特异性识别作用，且不影响PSA性质，可回收检材用于DNA分析，降低假阴性出现概率。党福全课题组[11]基于该序列制备的金纳米荧光探针，选择性实验表明，Mb,THF,LYZ,GOD,β-LAG,BSA等容易造成实验假阳性的蛋白不能使肽序列HSSKLQ裂解。

基于上述研究，通过改变肽序列长度，得到检测性能更优化的前列腺特异性抗原荧光探针。该探针为有机化合物，相对于现在法医物证广泛应用的免疫法的酶，其性质更加稳定且容易制备。通过荧光光谱测试，探针荧光强度与前列腺特异性抗原浓度（0～12.5μg/mL）成正相关和线性关系，且5min内均有较好的响应，可实现对PSA的快速定性定量分析。检测限为0.8μg/mL，远低于精液中PSA浓度，因而对检材需求量极少。另外，主流免疫学精液斑确证试验多局限于实验室，而本研究不同附着物上的精液样品检材荧光成像实验进一步证实了该荧光探针对PSA的实际检测效果，有望实现类似鲁米诺实验[12]用于犯罪现场精液斑的识别确证，以期更加便捷辅助侦破案件。

综上，本研究采用荧光共振能量转移机理，基于能被PSA特异性识别水解寡肽序列HSSKLQ，设计合成了前列腺特异性抗原靶向检测荧光探针Dabcyl-GGHSSKLQLAAAK-FAM。该探针检测性能良好，实际应用价值肯定。

参考文献：

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[2]侯一平,吴梅筠.人类精浆特异性抗原P30的研究进展[J].中国法医学杂志,1988,3(4):43-46.

[3]王炜,李传刚,刘辉,等.前列腺特异性抗原对前列腺癌诊断价值的探讨[J].中国医科大学学报,2015,45(1):61-69.

[5]朱少华,FraukeF.用双色荧光原位杂交技术鉴定血痕性别[J].中国法医学杂志,2004,19(3):151-153.

[8]张顺超,沈国励,李合松.共振能量转移技术在生命科学中的应用研究新进展[J].分析科学学报,2015,31(4):560-566.

[12]许林茹,何亚芸,苏彬.基于鲁米诺电化学发光成像的潜在指纹显现技术[J].化学通报,2014,77(1):86-89.

徐金贺,杨楠,杨林林,吉利国,李琳琳,王庆志,何广杰.一种基于FRET的PSA荧光探针的制备及法医学应用[J].中国法医学杂志,2020,35(03):302-304+308.

基金:河南省自然科学基金(182300410309);河南省科技攻关计划(182102310648);河南省高等学校重点科研项目(18A150044);新乡医学院研究生科研创新支持计划项目(YJSCX201705Z).