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在石油微生物学中基因工程的研究

2020-05-25 301 上传者：管理员

摘要：石油是一种黏稠、深褐色的液体，由不同烃类化合物和其他有机化合物组成的复杂混合物，其中包括一些有机金属组分，主要是矾和镍化合物.目前，88%的石油被开采为燃油和汽油，组成了世界上最重要的一次性能源之一，剩余的12%被加工为多种化工产品，如石蜡、润滑试剂、化肥、塑料和杀虫剂等。石油是地球上的不可再生资源，并且其价值昂贵，被誉为“工业的血液”和“黑金”。如果石油资源枯竭，会导致人类面临诸多困境。因此，如何提高石油开采和利用的高效性，是学术界和工业界共同关注的问题。随着现代生物技术的飞速发展，以及地球上石油资源的逐渐减少，生物技术与石油工程的关系也越来越密切.石油微生物学是微生物学的一个分支，负责研究能够代谢或转化原油以及精炼石油产品的所有微生物，包括细菌、产甲烷古生菌和一些真菌.通过分子生物学技术改变细胞遗传物质，获得新的生物遗传性状，最终达到新产品的生产或者极大提高原产品产量的技术.目前，基因工程在石油微生物学研究中也成为了热点之一。

关键词：
分子生物学
基因工程
生物技术
石油微生物学
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1、基因工程学概述

基因工程是在分子生物学和分子遗传学等学科基础上发展起来的一门重要的生物技术科学，是国内高校生命科学相关专业本科生的核心课程，其涉及的相关技术为生命科学领域的发展奠定了坚实的基础。同时，生命科学研究的进步又进一步扩充和发展了基因工程应用的深度和广度。自1973年诞生以来，已快速发展成为生命科学研究中发展迅速、影响重大的前沿学科之一。由于基因工程课程的核心内容重在技术理解和实践操作，加之其快速发展的特点，因此不断尝试改革本门实验课程的教学内容、方法和实践，对于把握最新科研动态以及提高学生的创新能力和实践能力，均具有重要的意义。

2、基因工程在石油微生物学中的应用

2.1生物驱油技术

据估测，在一个油藏中仍然有三分之二是未被开采的原油。传统技术即通过钻井或者压力差方法，只能获得5%～10%原始油层，采用驱油方案，例如向原始油层注入一些化学物质包括表面活性剂、乳化剂、聚合物、酸、分散剂等，降低原始油层的开采难度，可以使采油量增加到10%～40%。然而，这些方法不仅极大地增加成本，还会对产品自身带来质量的损害，产生一些毒害物质，造成严重的环境问题，非常不符合可持续发展方针。1926年，微生物驱油技术首次被提出，利用微生物或者微生物代谢产物提高驱油效率，是成本节约、环境友好的方法。一般来说，自然界存在的天然微生物都具有一定的局限性，例如，一种微生物能够产生大量的生物表面活性剂，却不能耐受开采环境；相反，其他一些具有耐受性的菌株，却不能产生足够的表面活性剂。因此，基因工程改造石油类微生物，获得一种既能耐受开采环境，又能生产大量次级代谢产物的菌株，是生物驱油技术必然的发展趋势.在中海油渤海SZ36-1油田，筛选有效激活体系，激活地层中有益微生物菌群，乳化分散原油、降低原油黏度，达到增强驱油效率的目的，效果良好。

为了获得更高效的微生物菌株，基因再编辑、原生质体融合以及点突变被广泛应用于相应的底盘细胞中.革兰氏阴性菌阴沟肠杆菌能产生不可溶的多聚物，用于增加底层渗透率，其产量可达到7.28g/L。但是，阴沟肠杆菌的最适生长温度是370C，最适生长pH为5-7.S.SUN等为了提高菌株的温度耐受性，将来源于嗜热杆菌(Gen6acillus)的基因组DNA提取后，电转化到阴沟肠杆菌细胞中，经过基因重组，得到了一株能够在54℃培养条件下，稳定生产生物多聚物，产量远远超过了野生型菌株，达到了8g/L。同时，重组菌株具有稳定的遗传性状，通过岩石驱替实验证明其确实能有效的促进驱油效率。此外，SUN等还通过原生质体融合手段，将阴沟肠杆菌和嗜热杆菌进行了细胞融合，得到一株杂合菌株，既提高了最适生长温度，也增加了菌株的最适生长pH范围(pH7--9)，同时，杂合菌株的多聚物产量仍然达到了7.5g/Lfsl。烷基化合物也是原油的主要成分，将其从长链降解为短链烷基化合物，是生物驱油的重要手段之一来源于芽抱杆菌单加氧酶LadA能催化饱和烷烃氧化为链烯醇类，完成长链烷烃(C15-C36)的裂解。为了提高LadA的催化活性，采用随机点突变手段，建立了随机筛选文库，获得了酶活性提高了2--3.4倍的突变体，含有突变体酶的荧光假单胞菌生长明显快于含有野生型酶的菌株。这些实验结果表明，基因工程技术在生物驱油技术具有非常重要的作用。

2.2在生物恢复中的应用

首先，通过基因工程手段，解析天然石油降解微生物的代谢途径和关键酶.例如，对多环芳烃降解的微生物恶臭假单胞菌)，其蔡分解代谢质粒上的第一个操纵子编码了将蔡转化为水杨酸的酶类，第二个操纵子则编码负责催化水杨酸转变为乙醛和丙酮酸.其中，蔡双加氧酶在PAH的降解中发挥了关键性的作用，其具有底物非特异性，能催化多种PAH、的化学反应。通过对蔡分解代谢途径和酶的生化分析，能够极大促进其他PAHs包括菲和葱化合物的降解。

其次，将已知的代谢途径进行改造、调控以及扩展，实现一种重组微生物的多功能化工程菌株荧光假单胞杆菌，含有异源蔡代谢途径的质粒，以及由感应蔡代谢的启动子调控的生物发光基因lux基因，这样重组菌既可以降解蔡化合物，也能实时检测降解的效率.利用该工程菌株能够完全清楚土壤样品中的PAH.二苯并曝吩是加氢脱硫处理燃料过程的常见含硫杂环化合物，红串红球菌本身具有催化二苯并曝吩脱硫的一系列酶，包括dszA,dszB和，dszC，从而消除该化合物的毒性和污染性.目前，红串红球菌已经成为商业脱硫流程中的担当菌株。将红串红球菌，dsz家族的酶通过异源启动子的作用，在假单胞菌中表达后，由于异源启动子不含有硫化物抑制区域，重组菌株极大程度的降低了对硫化物的敏感度，其消化二苯并曝吩的能力远高于野生型的红串红球菌.这些研究成果表明基因工程在石油生物恢复中也扮演十分重要的角色。

2.3生物燃料

生物燃料是利用可再生资源例如玉米、大豆、纤维素等生物质转化成的燃料，包括燃料乙醇、生物柴油等。将生物燃料按一定比例掺入汽油中，可以部分甚至完全替代石油资源，降低油耗量，同时能促进汽油的充分燃烧，降低二氧化碳等污染物质的排放.生物燃料的生产主要包括两种方式，一种是利用玉米等粮食为原料，而另一种则是通过转化地球上最为丰富的可再生资源—纤维素。然而，由于大量使用农产品为原料，势必会导致生物燃料“与人争粮”的现象更加严重。因此，科学家们开始利用基因工程技术，以木质纤维素为原料，研发高效生产生物燃料的途径，并获得了一定的成果突破。

纤维素的降解需要复杂的纤维素酶系，其中最基本的三种酶分别是负责从纤维素内部开始水解产生纤维二糖和纤维寡糖的内切葡聚糖酶，从纤维素两端进行水解的释放纤维二糖的外切葡聚糖酶和将纤维二糖和纤维寡糖分解形成葡萄糖的日一葡萄糖昔酶。通常，一种微生物具有纤维素酶降解体系，却不具有生物燃料合成途径，反之，具有生物燃料合成途径的微生物，却不含有纤维素酶体系.克服这一问题的方案，即将两种体系融合到一种微生物中，使重组菌株既能高效降解纤维素底物，也能工业化生产生物燃料.酿酒酵母作为传统的乙醇发酵菌株，被广泛地用作底盘细胞，构建纤维素酶表达体系，最终实现纤维乙醇的生产。

同步糖化发酵是将纤维素酶对纤维素底物的降解过程和酿酒酵母发酵过程同时进行的工艺，能消除酶水解过程中产生的葡萄糖和纤维二糖的反馈抑制作用，提高乙醇的产量。然而，一般纤维素酶系中都缺乏BCL1的活性，严重影响了纤维素酶的降解活性。因此，将BCL1在酿酒酵母中高效表达，是提高SSF的有效途径.TANG等通过比较了三种来源的葡萄糖昔酶的活性，发现来源于扣囊覆膜胞酵母的BCL1具有最高的表达活性，并且该工程菌能够利用酸处理玉米芯发酵乙醇，乙醇的产量达到了21.5g/L，比野生型菌株提高了89%。SSF在工业应用上具有一个限制性因素，即纤维素酶的表达、分离和纯化成本昂贵。近些年，生物统和加工过程将纤维素酶和半纤维素酶的表达、纤维素降解以及乙醇发酵在同一个过程中完成，这是实现纤维素底物转化乙醇的有效途径之一CBP有利于减少生物燃料转化过程的成本，并简化生产工艺。此外，纤维素酶还被自组装到酿酒酵母的细胞表面上，形成人造纤维小体复合物，从而达到纤维乙醇的CBP，但是目前的研究仍然处于初级阶段。

总之，基因工程已经开始应用于石油微生物领域中，改造后的工程菌在遗传性状和生物表型上都具有明显的优势。但是，对于石油微生物基因工程改造的研究，仍然相对比较落后，限制性因素主要包括三方面：第一，对微生物本身代谢途径、信号转导通路以及转录调控机制的阐述还不清楚;第二，具有良好作用的异源代谢通路与宿主微生物的兼容性不够；第三，也是最重要的一个因素，由于石油生产具有成熟的传统工艺，使科研工作者在一定程度上忽略了生物技术在石油微生物方面的应用。未来，随着生物技术的飞速发展和石油资源的短缺.基因工程与石油微生物工程改造的联系将会越来越密切。

参考文献：

[1]陈远童.正烷烃发酵生产长链二羧酸的研究和工业生产概况[J].生物工程学报.1986(01).

[2]黄正鹏,冯世功.生物科学领域的新学科《石油微生物学》[J].国外油田工程.1991(04).

黄亮.基因工程在石油微生物学中的研究[J].农家参谋,2020(15):296+298.