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探讨副溶血弧菌拟核相关蛋白H-NS对VP1687-1686的启动子区转录的抑制作用
摘要：为了探讨副溶血性弧菌拟核相关蛋白H-NS对Ⅲ型分泌系统(T3SS)VP1687-1686基因位点的转录调控，本研究提取副溶血弧菌hns突变株(Δhns)和野生株(WT)的总RNA，采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点，并根据产物的丰度判断H-NS对靶基因的调控关系；采用实时定量RT-PCR研究靶基因mRNA在WT和Δhns中转录丰度，以判定H-NS对靶基因的转录调控关系；将靶基因启动子区域DNA序列克隆至lacZ基因上游，将重组质粒转入WT和Δhns中，得到相应的LacZ菌株，通过LacZ报告基因融合实验研究H-NS对靶基因的调控关系；用PCR扩增靶基因的启动子区DNA序列，并纯化His-H-NS蛋白，通过凝胶阻滞实验(EMSA)研究His-H-NS是否对靶基因启动子区具有直接的结合作用。研究结果显示，T3SS的VP1687-1686只含有一个转录起始位点，位于翻译起始位点上游82bp处，且H-NS能够抑制其转录活性，但不能直接结合到VP1687-1686区的启动子区。另外，H-NS对calR的转录无调控作用，His-H-NS也不能结合到其启动子区。本研究的结果初步说明，H-NS能够间接抑制VP1687-1686的转录，该抑制机制与CalR无关联。
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副溶血弧菌是革兰氏阴性弧菌，广泛存在于海水和海产品中，具有嗜盐性，是一种常见的食源性致病菌。当人类食用被污染的海产品或是腌制食品时，副溶血弧菌可引起食物中毒，在临床上的主要症状表现为急性起病、腹痛、呕吐、腹泄、发热等，偶见由该菌引起的伤口感染和败血症(Brobergetal.,2011)。
许多细菌能表达一种被称为Ⅲ型分泌系统(TypeⅢsecretionsystem,T3SS)的“针状”蛋白注射装置，该装置与细菌的致病性相关，可将分泌性毒力因子“注射”进宿主细胞内而发挥致病作用。副溶血弧菌能表达两种T3SS，即T3SS1和T3SS2(Makinoetal.,2003)。T3SS1的基因位点(VP1702-1656)位于大染色体上，共47个基因组成至少9个操纵子(Makinoetal.,2003)。其中，操纵子VP1701-1702、VP1700-1695和VP1699-1695可编码ExsA(VP1699)-ExsC(VP1701)-ExsD(VP1698)-ExsE(VP1702)调控系统，其对T3SS1的基因表达具有紧密的调控作用(Zhouetal.,2010;Erwinetal.,2012)。ExsA是正调控因子，能够激活T3SS1基因的表达，并受ExsD、ExsC和ExsE的调节。ExsD是一个抗激活因子，能够与ExsA结合来抑制T3SS1基因的转录；ExsC是抗抗激活因子，通过结合ExsD而阻止其对ExsA的结合；ExsE可通过集合ExsC而阻止其调控活。T3SS1存在于所有的副溶血弧菌菌株中，主要具有细胞毒性和小鼠致死毒性(Onoetal.,2006;Hiyoshietal.,2010)。
副溶血弧菌T3SS2的基因位点(VPA1370-1320)位于小染色体的致病岛内，也至少包含10个操纵子(Makinoetal.,2003)。T3SS2的表达受其位点内编码的调控蛋白VtrA(VPA1332)和VtrB(VPA1348)的激活(Kodamaetal.,2010)。T3SS2被认为只存在于神奈川现象阳性菌株中，但一些神奈川现象阴性菌株中也含有不完整的T3SS2(Okadaetal.,2009)。T3SS2主要发挥肠毒性作用，但是也具有一定的细胞毒性，如对部分细胞系如结肠癌细胞(Caco-2)及人回盲肠腺癌细胞(HCT-8)具有一定的毒性作用(Kodamaetal.,2007)。
拟核相关蛋白是一种普遍存在于革兰阴性菌中的整体负调控因子。H-NS没有保守的结合基序，但对富含A-T且有一定弯曲弧度的DNA片段具有比较强的亲和力，故而通常对水平转移获得的外源性基因具有抑制作用(Dorman,2010)。在副溶血弧菌中，H-NS可分别结合到exsA、exsC和exsD的启动子区，来抑制T3SS1的表达和细胞毒性。另外，H-NS可通过直接抑制vtrA及tdh2(热稳定性溶血素TDH的编码基因)的转录，来调控副溶血弧菌的肠毒性和溶血活性(Sunetal.,2014)。然而，H-NS是否对T3SS1和VpPAI内的其他操纵子也具有直接的调控作用，还需进一步研究。VP1686编码T3SS1的一个分泌蛋白，能够增加巨噬细胞的吞噬活性，诱导巨噬细胞凋亡，且VP1687和VP1686两者共转录(Bhattacharjeeetal.,2006;Bhattacharjeeetal.,2008)。本研究中，研究者研究了H-NS对T3SS1相关基因VP1687-1686的转录调控机制，结果显示H-NS间接抑制其转录。
1、结果和分析
1.1H-NS负调控VP1687的转录
首先采用引物延伸实验研究VP1687的转录起始位点，结果表明(图1A):VP1687的转录起始位点为-82位的G(翻译起始位点为+1)；且结果显示Δhns中VP1687基因的mRNA表达量高于WT，表明H-NS可以负调控VP1687的转录活性。其次，采用qRT-PCR的方法进一步来验证H-NS对VP1687的转录调控作用，分析mRNA在WT和Δhns中转录丰度，qRT-PCR鉴定结果显示(图1B)：Δhns中VP1687mRNA丰度明显高于WT(p<0.01)，表明H-NS抑制VP1687的转录，此结果与引物延伸结果一致。
为了进一步研究H-NS对VP1687启动子区活性是否具有调控作用，在WT和Δhns中分别导入含VP1687启动子DNA序列的LacZ重组质粒，使用LacZ报告基因融合实验检测其转录活性，结果显示(图1C)：Δhns中的β-半乳糖苷酶活性(Millerunits)明显高于WT，且二者具有显著性差(p<0.01)，表明H-NS能够抑制VP1687的启动子区活性。上述实验表明H-NS对VP1687转录起负调控作用。
图1H-NS抑制VP1687的转录
进一步研究H-NS是否对VP1687的启动子区DNA具有直接的结合作用。EMSA结果显示(图2)：随着H-NS蛋白浓度的升高并没有出现阻滞条带，当H-NS蛋白浓度达到22.4pmol时依然不能结合到VP1687的启动子区，而19.2pmol的His-H-NS就几乎可以完全阻滞exsA、exsB或vtrA的启动子区DNA迁移(Sunetal.,2014)，表明His-H-NS不能结合到VP1687的启动子区，H-NS只能间接抑制VP1687的转录。
1.3H-NS不调控calR的转录
Whitaker等(2012)的研究结果显示CalR是T3SS1基因表达的负调控因子。那么，H-NS是否对calR的转录也具有调控作用呢？
首先采用引物延伸实验研究H-NS对calR基因的调控关系，结果显示calR的转录起始位点为T，位于起始密码子ATG上游156bp，且WT和Δhns中calR基因的mRNA表达量没有差异(图3A)。然后利用qRT-PCR研究calR基因的mRNA在WT和Δhns中转录丰度，qRT-PCR鉴定结果显示(图3B):WT和Δhns中VP1687mRNA丰度没有明显差异，表明H-NS不调控calR基因的转录，此结果与引物延伸结果一致。
图2His-H-NS结合VP1687启动子区的EMSA
进一步在体外进行的LacZ报告基因融合实验结果显示：Δhns中测得的β-半乳糖苷酶活性与WT基本相同，无显著性差异(图3C)，这同样说明H-NS不调控calR基因的转录。最后利用EMSA实验验证H-NS是否对calR的启动子区DNA具有直接的结合作用，结果显示H-NS不与calR基因的启动子区结合(图3D)。综合上述结果：H-NS不调控calR的转录，也不能结合到calR的启动区，表明H-NS不能通过调控calR的转录来调控T3SS1的表达。
2、讨论
副溶血弧菌的T3SS1与鼠疫菌的T3SS高度同源(Parketal.,2004)。鼠疫菌T3SS由pCD1质粒编码，其表达水平受Ca2+和温度的调节，在37℃缺乏Ca2+的环境下表达水平最高(Fieldsetal.,1994)。在37℃时，T3SS基因转录，包括Yops基因、lcrGVH-yopBD和yscABCDEFGHIJKLM等，都可被转录因子LcrF直接激活(PlanoandSchesser,2013)，而LcrF自身表达也受温度调控(HoeandGoguen,1993)。25℃时YomA可抑制lcrF的表达，H-NS对LcrF的表达也具有直接的抑制作用(DelaCruzetal.,1992;B觟-hmeetal.,2012)。另外，鼠疫菌T3SS的表达还受谷氨酸水平、pH改变、是否接触真核细胞等因素调节(Brubaker,2005)。
图3H-NS不调控calR的转录
副溶血的T3SS1也是一种被多种因素紧密调控的蛋白分泌装置，与鼠疫菌的T3SS类似，T3SS1也受金属离子的调控，高Ca2+或低Fe2+条件可促进T3SS1的表达(Gode-Potratzetal.,2010)。进一步研究表明：LafK可感应高Ca2+信号，而激活T3SS1的表达；相反，CalR可感应低Ca2+信号，而抑制T3SS1的表达(Gode-Potratzetal.,2010)。ToxR可通过激活calR的转录，而抑制T3SS1的表达(Whitakeretal.,2012)。
密度感应系统(quorumsensing,QS)也可调控T3SS1的表达。T3SS1基因的转录受QS高密度下的核心调控子OpaR的抑制，而受低密度下的核心调控子AphA的激活(Gode-PotratzandMccarter,2011;Wangetal.,2013)。ExsA是LcrF的同源蛋白，研究显示ExsA连同ExsC、ExsD和ExsE可紧密调控T3SS1基因的转录(Zhouetal.,2010;Erwinetal.,2012)。研究人员前期的研究表明H-NS可分别与exsA、exsC和exsD的启动子区域相结合来抑制其转录，从而抑制T3SS1的表达(Sunetal.,2014)。然而，H-NS对T3SS1基因表达调控的深入机制，还需进一步探讨。
本研究利用分子生化实验研究了H-NS对T3SS1相关基因VP1687-1686的转录调控机制。引物延伸和qRT-PCR结果表明VP1687-1686只有一个转录起始位点，且H-NS能够抑制其转录活性；LacZ实验表明H-NS能够抑制VP1687-1686的启动子活性；而EMSA结果显示His-H-NS不能结合到VP1687-1686的启动子区DNA序列上。结合前期的研究结果(Zhangetal.,2016)，可知H-NS是通过直接抑制ExsA-ExsC-ExsD-ExsE调控系统中相关基因的表达，来间接抑制VP1687-1686的转录。CalR是LysR家族的转录调控因子，能抑制T3SS1相关基因的表达(Whitakeretal.,2012)。研究人员未发表的研究数据显示CalR对exsB和VP1687-1686的启动子区均具有直接的结合作用。然而，本研究的结果显示H-NS对calR的转录无调控作用，说明H-NS不可以通过直接调控calR的转录来调控T3SS1的表达。
3、材料与方法
3.1供试菌株
本研究选取：副溶血弧菌RIMD2210633(野生型,WT)、hns缺陷菌株(Δhns)、His-H-NS蛋白表达菌株、pHRP309质粒等进行试验，这些菌株均由本实验室保存。
3.2主要材料与试剂
HI培养基(即2.5%Bactoheartinfusion)(BDBiosciences公司)；DNA聚合酶(pfu,Taq)及dNTPs(Fermentas公司)；DNA2000Marker(大连TaKaRa公司)；TRIzol(Invitrogen公司)；引物延伸和测序盒(Promega公司)；PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN公司)；DNA消化试剂盒(Amibion公司)；实时定量PCR预混液(Roche公司)。
3.3细菌培养
取15μL保存的甘油菌种子液转接至15mL新鲜的HI肉汤培养基中，37℃条件下振荡(200r/min)培养12～14h;1∶50转接至15mL新鲜HI肉汤中，相同条件下培养至对数中期(OD600≈1.0)；按1∶1000转接至15mLHI肉汤中，相同条件下培养至OD600≈0.4，收集菌体，备用。
3.4实时定量PCR(qRT-PCR)
用TRIzol法提取WT和Δhns的总RNA，随后用DNA消化试剂盒消化去除污染的DNA，用N6随机引物将RNA逆转录成cDNA，使用基因特异性引物进行扩增(表1)。以16SrRNA作为内参基因，采用2-ΔΔCt相对定量的方法来分析各个目的基因的表达情况(Gaoetal.,2011)。
3.5引物延伸实验
将与靶基因mRNA互补的特异性引物(表1),5'-末端进行32P放射性标记(Gaoetal.,2011)，而后将其退火至mRNA上，并利用逆转录酶延伸引物。使用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测延伸产物和测序反应生成的条带，对照测序图分析延伸产物的大小和转录起始位点。
3.6LacZ报告基因融合实验
分别将VP1687-1686及calR启动子区域DNA序列克隆至pHRP309质粒中，插入位置为β-半乳糖苷酶基因(无启动子区)上游，构建LacZ重组质粒，分别将两种质粒转入WT和Δhns中，制备相应的LacZ菌株。LacZ菌株按上述3.3描述的方法培养后，收集菌体，用β-半乳糖苷酶检测试剂盒检测β-半乳糖苷酶活性(Millerunits)。
3.7凝胶阻滞实验(EMSA)
PCR分别扩增VP1687-1686及calR的启动子区域DNA序列，用[γ-32P]-ATP对DNA片段的5'-末端进行标记，来制备特异性的DNA探针。将不同浓度的His-H-NS蛋白与DNA探针置于结合反应体系中，室温孵育20min，使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA条带，-0℃下放射自显影后，分析结果。
张盈,唐浩,仇越,王丽,张义全.副溶血弧菌拟核相关蛋白H-NS间接抑制VP1687-1686的启动子区转录[J].基因组学与应用生物学,2020,39(03):1450-1456.
基金:江苏大学高级专业人才科研启动基金项目(14JDG166;13JDG026)资助.
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期刊名称：中国细胞生物学学报
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主管单位：中国科学院
主办单位：中国细胞生物学学会,中国科学院上海生命科学研究源生物化学与细胞生物学研究所
出版地方：上海
专业分类：生物
国际刊号：1674-7666
国内刊号：31-2035/Q
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创刊时间：1979年
发行周期：月刊
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