松材线虫病是由松材线虫引起的一种极具破坏性的森林病害。该病传播蔓延迅速,防治难度大,已成为我国最具危险性的森林灾害。松材线虫病是一个复杂的病害系统,多种因素如松材线虫、寄主植物、媒介昆虫、伴生真菌和细菌、经济物流活动及环境因子相互作用,导致其致病机理尚存争议[1,2]。

蒎烯类物质在松材线虫与寄主互作的过程中发挥了重要作用。松树产生的蒎烯类次级代谢物质可以增强植物对外界生物胁迫的抵抗能力[3],提高对于一些非松树害虫和病原真菌的毒杀和趋避作用[4,5,6]。当松材线虫侵染松树后,大量增加的挥发性蒎烯类物质可导致木质部的管胞形成空洞,使松树因水分输导受阻而枯死[7,8]。α和β-蒎烯是松树产生的主要蒎烯类物质,α和β-蒎烯在较低质量浓度时均可抑制松材线虫的繁殖,而较高质量浓度时均可促进松材线虫的繁殖[3]。除蒎烯的种类和质量浓度外,松材线虫侵染松树的过程中,树体内α和β-蒎烯比例会发生明显地改变。健康松树体内α与β-蒎烯的比例为1.0∶0.1,在受到松材线虫侵染枯死后,树体内的α与β-蒎烯的比例变为1.0∶0.8[9,10]。

松材线虫在侵染松树的过程中,寄主产生的α和β-蒎烯质量浓度和比例能够对松材线虫的繁殖产生显著影响。本研究按一定比例对2种蒎烯进行混合,研究其对松材线虫种群繁殖的影响,并采用RNA-Seq技术对α和β-蒎烯处理下松材线虫转录组进行分析,明确了松材线虫响应α和β-蒎烯胁迫的分子特征,并分析了与松材线虫蒎烯代谢相关的功能基因,为进一步揭示松材线虫响应蒎烯类物质胁迫的机制提供基础。

1、材料与方法

1.1供试虫源

选用中国林业科学研究院森林病原整合生物学研究室保存的松材线虫Nxy61虫株,该虫株于浙江宁波市发病的马尾松(Pinusmassoniana)上获得,通过贝尔曼漏斗法分离、镜检、纯化后灰葡萄孢(Botrytiscinerea)培养。试验采用的松材线虫为混合虫态(卵、幼虫及成虫),将50μL线虫液(约100头线虫)接种于灰葡萄孢PDA平板,25℃黑暗条件下培养7d,收集线虫,加入链霉素(100mg·L-1)、氯霉素(20mg·L-1)静置8h,6500r·min-1离心3min,去掉上清液,再用PBST缓冲液冲洗3次,收集松材线虫。

1.2蒎烯处理液制备

松树受到松材线虫侵染后,树体内α与β-蒎烯比例由1.0∶0.1变为1.0∶0.8,选择α与β-蒎烯比例为1.0∶0.4来模拟松材线虫在侵染过程中树体内2种蒎烯的变化,按照1.0∶0.4的比例混合制备质量浓度为4.29、17.16、25.74、42.90、128.70、214.50g·L-1蒎烯处理液,用0.5%TritonX-100作为对照(CK)。

1.3蒎烯对松材线虫繁殖率影响的测定

采用棉球生测法测定蒎烯在短时和长时处理条件下对松材线虫繁殖率的影响。短时处理,分别用6种质量浓度的α和β-蒎烯混合液浸泡松材线虫48h,收集线虫,然后接50μL线虫液(500头线虫)到灰葡萄孢的PDA平板上,对照用50μL的0.5%TritonX-100溶液浸泡处理。长时处理,在长满灰葡萄孢的PDA平板中央用5mm无菌打孔器打孔,放入无菌脱脂棉球,在棉球上加入50μL不同质量浓度的蒎烯,同时往菌丝上加入50μL的松材线虫液(500头线虫),对照加入50μL的0.5%TritonX-100溶液。2种处理及对照均在25℃黑暗条件下培养7d,然后分离和收集松材线虫,统计松材线虫成虫、幼虫和卵的数量,每种处理重复5次。

1.4蒎烯胁迫对松材线虫影响的基因检测

松材线虫的蒎烯处理:采用1.1的方法制备松材线虫,根据生理测定的结果选用质量浓度为17.16g·L-1的蒎烯对松材线虫浸泡48h,收集线虫,将用PBST缓冲液冲洗后的线虫分装至去RNA酶的1.5mL离心管中,每管约2万头,12000r·min-1离心3min去上清,液氮处理后置于-80℃保存备用,重复3次,以0.5%TritonX-100浸泡处理作为对照。

松材线虫总RNA的提取及检测:采用Trizol试剂法提取蒎烯处理后松材线虫的总RNA,通过分光光度仪(NanoDrop1000)检测RNA的浓度和纯度,1%琼脂糖电泳检测RNA的完整性和质量,RNA样品合格后置于-80℃保存备用。

cDNA文库构建和上机测序:用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA,然后加入碎片化缓冲液将mRNA打断成短片段,以mRNA目的片段为模板,用六碱基随机引物合成cDNA第1链,再加入缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶I合成cDNA第2链,采用核酸纯化试剂盒(AMPureXP)纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头,然后再用磁珠(AMPureXP)进行片段大小选择,通过PCR富集得到最终的cDNA文库。cDNA文库的构建与测序及后续的数据分析由北京诺禾致源生物信息科技有限公司协助完成。

差异表达基因的筛选及分析:首先用edgeR工具包对各个数据库进行数据归一化,再利用DEGSeq工具包对蒎烯处理下的差异表达基因进行计算和分析,以P<0.05和|log2(差异倍数)|≥1作为差异基因表达的界定标准,并将差异基因分为上调和下调表达两类。用GOseqR工具包进行差异表达基因的GO富集分析(P<0.05),用KOBAS软件进行差异表达基因的KEGG富集分析(P<0.05)。

差异表达基因的实时定量PCR验证:采用RNA微量提取试剂盒(RneasyMicroKit)提取松材线虫蒎烯处理组和对照组总RNA,采用反转录试剂盒(PrimescriptRTreagentKitwithgDNAEraser)将松材线虫的RNA反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR试剂盒(TBGreenTMFastqPCRMix),在罗氏LC480实时荧光定量PCR仪上进行反应,以肌动蛋白基因作为内参基因,采用2-ΔΔCT法计算各差异基因的相对表达量[11],每个处理重复3次。利用Sigma在线工具OligoArchitectTM(http://www.oligoarchitect.com)设计RT-PCR引物,引物见表1。

表1Real-timePCR所用引物

1.5数据分析

采用SPSS19.0和Excel2013对数据进行处理和分析,使用SPSS的独立样本T检验进行单因素方差分析(P<0.05)。

2、结果与分析

2.1蒎烯对松材线虫繁殖率的影响

由表2可见,短时处理条件下,随着蒎烯质量浓度的升高,松材线虫的繁殖率呈现由低到高的变化规律。当蒎烯质量浓度相对较低时(4.29、17.16、25.74g·L-1),松材线虫的繁殖率明显低于对照,表明低质量浓度蒎烯能够抑制松材线虫繁殖,其中质量浓度为17.16g·L-1时抑制效果最为明显,种群数量仅为3667头;当蒎烯质量浓度升高时(42.90、128.70g·L-1),松材线虫的繁殖率明显高于对照,表明高质量浓度蒎烯能够促进松材线虫繁殖,其中在质量浓度为42.90g·L-1时促进作用最明显;当质量浓度继续升高时,蒎烯则抑制松材线虫繁殖。长时处理条件下,松材线虫的繁殖率呈现先下降再上升的趋势。与短时处理相比,当蒎烯质量浓度为4.29g·L-1时能够促进松材线虫的繁殖(P<0.05),当质量浓度为17.16、25.74g·L-1时对松材线虫繁殖率无显著影响,当蒎烯质量浓度升高时(42.90、128.70g·L-1),则可促进松材线虫繁殖(P<0.05)。α和β-蒎烯共同作用下对松材线虫的繁殖率测定结果表明,2种蒎烯对松材线虫的繁殖率具有明显的调节作用,17.16g·L-1的短时处理对松材线虫的繁殖抑制效果最明显。

表2α和β-蒎烯混合液对松材线虫繁殖率的影响

注:表中数据为平均值±标准差,n=3。同列数据后不同小写字母表示处理间的差异显著性(P<0.05)。

2.2差异表达基因

低质量浓度(17.16g·L-1)的α和β-蒎烯处理共获得146条差异表达基因,其中上调表达116条,下调表达30条,上调表达的前20个差异基因功能主要包括:氧化还原酶活性、类固醇激素受体蛋白、转录受体蛋白、水解酶、酯酶及酸性磷酸酶活性,而下调表达的前15个差异基因功能主要包括:氧化还原酶活性、氨基酸转运体蛋白、乙醇脱氢酶活性、双加氧酶、精氨酸激酶等(表3)。上调表达基因中,氧化还原活性基因主要以解毒基因为主,包括细胞色素酶P450基因家族(CYP450)、葡萄糖醛酸脱氢酶家族(UGT)以及短链脱氢酶基因家族(SDR)。

表3蒎烯诱导后松材线虫主要差异表达基因

2.3差异表达基因的GO功能分类

通过比对松材线虫基因组对转录组测序结果进行GO功能分类富集分析(P≤0.05),发现差异表达基因主要富集在两类生物学过程,即生物过程和分子功能。其中生物学过程主要包括:氧化还原作用(GO:0055114)、脂类代谢(GO:0030258)、代谢过程(GO:0008152)、单体生物代谢过程(GO:0044710)等;分子功能主要包括:氧化还原酶活性(GO:0016491)、催化活性(GO:0003824)、辅助因子结合(GO:0048037)、血红素结合(GO:0020037)、吡咯结合(GO:0046906)、黄素单核甘酸结合(GO:0010181)、铁离子结合(GO:0005506)等,其中细胞色素P450是一种血红素结合蛋白,而血红素结合(GO:0020037)和铁离子结合(GO:0005506)等GO的显著富集,说明在松材线虫响应蒎烯的过程中表面氧化还原作用是主要的生物学过程,氧化还原酶是主要的功能蛋白,CYP450是一类重要的参与松材线虫应对蒎烯胁迫、具有氧化还原作用的氧化还原酶。

对GO富集分类的基因统计表明,基因以上调表达为主,富集基因较多的生物学过程,包括代谢过程上调表达62条,下调表达16条;单体代谢上调表达55条,下调表达16条;氧化还原过程上调表达29条,下调表达7条;其他的生物学过程包括脂类代谢、碳水化合物代谢等也以上调表达为主。富集基因较多的分子功能包括分子过程上调表达81条,下调表达23条;催化活性上调表达67条,下调表达15条;氧化还原酶活性上调表达30条,下调表达6条;同样以上调表达为主(表4)。

2.4KEGG代谢途径富集通路

通过KEGG富集对蒎烯处理后的差异表达基因进一步分析,在富集最显著的20条代谢通路中,外源物质的P450代谢通路和药物代谢通路的富集程度最大,二者均与有毒物质的代谢有关;其他代谢通路包括近端小管碳酸盐回收,通过碳酸根离子的释放和回收来调节体腔内pH平衡,保证松材线虫体液平衡;维生素B6的代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解通路;氯化烷烃等外源性物质的降解和代谢通路;以及酪氨酸代谢、脂肪酸代谢、过氧化物酶体通路等(图1)。为应对蒎烯胁迫,除了以氧化还原为主的外源物质代谢外,松材线虫还通过氨基酸代谢和碳水化合物代谢等其他途径进行应对,包括生长调控、表皮蛋白变化等,消除蒎烯对自身的危害。

表4蒎烯处理松材线虫差异表达基因的GO功能分析

图1蒎烯胁迫下松材线虫差异表达基因KEGG富集散点图

2.5差异表达基因的实时定量PCR验证

通过功能分析,选择差异表达数量丰富且在GO分类和KEGG代谢通路中均显著富集的12个差异基因,通过设计特异性引物(表1)进行实时定量PCR分析,验证12个差异基因在松材线虫中的表达情况,其中CYP-33C1、CYP-33C4、CYP-33C2、CYP-33C9、UGT-48、DHS-2、DHS-27为上调表达基因,gsnl-1、F13H6.3、TBC1D5、ZK550.6、HSD17B13为下调表达基因,定量PCR的分析结果与转录组测序的结果一致(表5)。

表5α和β-蒎烯处理下松材线虫基因的相对表达量

注:表中数据为平均值±标准差,n=3。

3、结论与讨论

松材线虫病作为我国最具危险性的森林病害,已对我国的松林生态系统造成了严重的危害。在松材线虫侵染致病过程中,松树蒎烯类次级代谢物质在松材线虫致病与寄主防御过程中发挥了重要作用。

松材线虫侵染松树后,松树代谢产生的主要蒎烯类物质为α-蒎烯、β-蒎烯和长叶烯[12],在不同的侵染阶段松树体内α和β-蒎烯比例会发生明显地改变。寄主产生的α和β-蒎烯均可对松材线虫种群繁殖产生不同程度的影响[13],其中α和β-蒎烯在较低质量浓度时可抑制松材线虫的繁殖,而较高质量浓度时可促进松材线虫的繁殖[3]。本研究对α和β-蒎烯混合后对松材线虫繁殖影响的研究表明,混合后的蒎烯对松材线虫种群繁殖同样存在显著的影响,与α和β-蒎烯单独处理相比[3],α和β-蒎烯混合处理对松材线虫种群繁殖的影响更明显。α和β-蒎烯68.80g·L-1单独处理松材线虫时会抑制其繁殖[3],但α和β-蒎烯混合处理质量浓度为17.16g·L-1时则可明显抑制松材线虫的繁殖。α和β-蒎烯275.20g·L-1单独处理松材线虫时可促进其繁殖率[3],α和β-蒎烯混合处理促进松材线虫繁殖的质量浓度要远低于单独处理,分别为短时处理的42.90g·L-1和长时处理的4.29g·L-1。松树蒎烯特别是高质量浓度单萜类物质的积累是松树响应生物胁迫的主要防御反应[14,15],而高质量浓度蒎烯处理能显著增加松材线虫种群的繁殖,说明在松材线虫体内含有大量表达解毒作用和繁殖相关的基因应对蒎烯胁迫,从而保障松材线虫在松树体内成功定殖并使其种群持续增长,最终导致松树萎蔫死亡[8,16,17,18]。

通过对受蒎烯抑制后松材线虫转录组的分析,得到多条与松材线虫应对蒎烯胁迫相关的基因,蒎烯处理后松材线虫的差异基因以上调表达为主,主要包括细胞色素酶P450基因家族、葡萄糖醛酸脱氢酶家族和短链脱氢酶基因家族以及其他氧化还原酶和激素受体,其中细胞色素酶P450基因家族(CYP450)和葡萄糖醛酸脱氢酶家族在GO分类和KEGG代谢通路中都显著富集。CYP450代谢途径是生物体降解有毒物质的重要代谢途径,推测细胞色素酶P450基因家族和葡萄糖醛酸脱氢酶家族有可能是松材线虫在侵染松树的过程中响应蒎烯胁迫的关键基因,并且起到了防御和解除蒎烯胁迫的作用[19]。除了CYP450等解毒基因外,NADH氧化酶和水解酶同样在松材线虫响应蒎烯胁迫时发挥了重要作用。此外,在上调表达基因中的修补相关蛋白PTCHD3和PTCHD9可以调控蜕皮周期、表皮蛋白以及正向调控多细胞组织的生长,说明松材线虫的生长调控蛋白在蒎烯处理下也表现出一定的响应且对蒎烯的胁迫产生了防御。核受体亚家族Ⅱ属于类固醇激素受体蛋白具有转录调控功能,对松材线虫适应胁迫同样发挥了重要作用。

本研究在α和β-蒎烯对松材线虫的繁殖影响结果的基础上,对受蒎烯抑制后松材线虫转录组进行分析。蒎烯质量浓度会对松材线虫的种群繁殖产生显著影响,并且松材线虫对α和β-蒎烯共同作用的反应更敏感。细胞色素酶P450基因家族和葡萄糖醛酸脱氢酶家族可能在松材线虫响应蒎烯胁迫的过程中发挥了重要作用,松材线虫通过体内的解毒基因(CYP450)对蒎烯进行氧化还原修饰、在离子和小分子转运蛋白协助下对蒎烯进行降解,同时部分上调表皮蛋白合成基因也参与该过程。本研究阐释了松材线虫在蒎烯胁迫下生理和分子水平上的变化,为进一步揭示松材线虫应对蒎烯胁迫的分子机制提供基础。

参考文献：

[1]张星耀,骆有庆.中国森林重大生物灾害[M].北京:中国林业出版社,2003:1-29.

[2]理永霞,张星耀.松材线虫病致病机理研究进展[J].环境昆虫学报,2018,40(2):231-241.

[13]谈家金,郝德君,潘玉雯,等.几种松树挥发物对松材线虫行为的影响[J].东北林业大学学报,2009,37(12):58-59.

[19]王璇,理永霞,刘振宇,等.松材线虫CYP450基因与松树蒎烯类物质代谢的相关性[J].林业科学,2017,53(6):105-110.

刘振凯,崔晶,理永霞,邓勋,张星耀.α和β-蒎烯胁迫下松材线虫转录组特征[J].东北林业大学学报,2020,48(05):93-98.

基金:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(CAFYBB2017SY046).