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耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌医院感染监测中MLST和PFGE的应用

2020-06-20 267 上传者：管理员

摘要：目的：探讨某院重症监护病房(ICU)患者、医院环境中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)菌株的同源性,为医院感染防控提供理论依据。方法：收集2017年9—12月某三甲医院ICU患者、环境中连续分离的CRKP菌株,进行耐药表型、碳青霉烯酶基因检测,采用多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子同源性分析。结果：共收集10株CRKP菌株,其中9株分离自5例患者的临床感染标本,1株分离自气压治疗仪面板。10株菌均携带产KPC酶基因;MLST分型均为ST11型;共有5种PFGE带型,其中5株带型完全一致,为流行菌株,1株菌株与流行菌株带型仅相差1条条带,其余4株菌带型相近,但与流行株带型差异较大。气压治疗仪面板分离的1株CRKP菌株与患者来源的4株CRKP菌株耐药表型、PFGE型别及ST型别完全一致,考虑为仪器共用造成的医院感染。分离自同一重症胰腺炎患者腹腔引流液、血标本的CRKP菌株PFGE带型完全一致,推测CRKP可能通过腹腔感染入血。结论：PFGE和MLST对明确医院感染细菌传播路径,个体细菌感染路径以及遗传变异有重要意义,有助于从切断感染途径方面入手指导控制多重耐药菌的传播。

关键词：
医院感染
多位点序列分型
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌
脉冲场凝胶电泳
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肺炎克雷伯菌属于人体正常菌群,也是条件致病菌,其引起的社区获得性和医院获得性感染逐年增加,特别是高毒力肺炎克雷伯菌和多重耐药肺炎克雷伯菌的传播,给临床治疗带来极大的困难[1]。临床重症感染患者的不断增加,碳青霉烯类抗生素的广泛使用,使得耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株检出呈逐年增多的趋势。CRKP具有在医院广泛传播的潜在风险,其引发的临床感染病死率较高,治疗药物有限,给患者、医院和社会带来极大的影响和危害[2]。多位点序列分型和脉冲场凝胶电泳是两种最常用于细菌分型的分子生物学方法,可用于分析医院分离CRKP的基因型和同源性,从切断感染途径方面入手指导、控制多重耐药菌的传播。本研究收集某医院重症监护病房(ICU)4个月内连续检出的10株CRKP,进行抗菌药物敏感性试验和碳青霉烯酶基因检测,并应用MLST和PFGE方法进行菌株同源性分析,发现其传播规律和流行特点,为医院感染暴发的有效预防提供防控依据。

1、资料与方法

1.1菌株来源

收集2017年9—12月某三甲医院ICU连续检出的CRKP。

1.2主要仪器试剂

VITEK2Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统、GN革兰阴性菌鉴定卡片、AST-GN13革兰阴性菌药敏卡片(法国Biomerieux),GeneXpert分子诊断系统、Xpert○RCarba-R碳青霉烯酶基因检测试剂盒(美国Cepheid),抗菌药物药敏纸片(英国Oxoid),血琼脂培养基、M-H培养基(郑州安图生物),质控菌株大肠埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCCBAA1705和ATCCBAA1706(国家微生物菌种保藏中心)。聚合酶链式反应(PCR)扩增仪、凝胶电泳成像系统、CHEFMapperXa脉冲场凝胶电泳系统(美国Bio-Rad),限制性内切酶XbaI(中国TaKaRa),GelRed核酸染料(美国Biotium)。

1.3抗菌药物敏感性试验

采用VITEK2Compact系统和配套的细菌鉴定卡片、药敏卡片进行鉴定以及相应的药敏试验,检测抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC),采用K-B法补充检测部分药物敏感试验。药敏结果依据美国临床实验室标准化协会(CLSI)药敏试验2019年M100-29th标准判断结果。

1.4碳青霉烯酶检测

根据CLSIM100-29th肠杆菌科细菌碳青霉烯酶检测方法进行mCIM试验和eCIM试验,采用赛沛Xpert○RCarba-R试剂盒检测blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48和blaIMP5个碳青霉烯酶基因。

1.5多位点序列分型(MLST)

采用煮沸法提取细菌DNA,PCR扩增rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB7个管家基因,引物参考Pasteur数据库。PCR条件:94℃2min,94℃30s、50℃1min、72℃30s共35个循环,72℃5min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定为单一条带后,送上海生工生物公司测序。将管家基因的序列在Pasteur数据库进行比对,获得管家基因型别,将7个管家基因型别组合获得菌株ST型别。

1.6脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析

参考美国疾病控制与预防中心(CDC)PulseNet提供的PFGE相关标准化操作程序,调整相关电泳条件,试验方法如下:用比浊仪调整细菌悬液浓度,达4.2～4.5麦氏浊度单位;加入1%SeakemGold:1%SDS胶,混匀制备胶块;用含蛋白酶K的细胞裂解液CLB在54℃水浴摇床中强力震荡(170～180r/min)消化2h;用无菌纯水洗涤胶块2次,TE缓冲液洗涤胶块3次;加入20UXbaⅠ限制性内切酶按比例配制酶切反应体系,37℃水浴孵育6～8h后,电泳仪中进行脉冲场电泳;电泳参数为电场强度6V/cm,夹角120度,初始脉冲为6s,最终脉冲为36s,电泳时间19h;电泳结束后,使用GelRed核酸染料染色,在美国Bio-Rad凝胶成像系统中成像保存图片。

1.7数据处理

应用BioNumerics软件进行数据分析,选择Diec相关系数和UPGMA方法。

2、结果

2.1一般资料

共收集ICUCRKP菌株10株,分别标为1、2、3…10号菌株,其中1～8、10号菌株分离自5例(分别标为A、B、C、D、E)患者的临床感染标本,9号菌株分离自病房气压治疗仪面板。5例患者均为男性,年龄28～55岁,平均(46.2±11.3)岁;患者A、C、D痰标本,患者B血、引流液标本,以及患者E血、分泌物标本中各分离1株CRKP菌株,患者E痰标本中先后分离2株CRKP。同期ICU医生、护士的手,治疗车、监护仪、微量泵、血气分析仪、床栏、床头柜、门把手,以及护士长使用的电脑键盘等32个部位环境监测标本中均未分离出CRKP菌株。

2.2药敏结果

10株CRKP菌株对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类和碳青霉烯类抗菌药物均呈高水平耐药;6～8号及10号CRKP菌株对四环素类抗生素敏感,其余1～5号及9号CRKP菌株对包括替加环素在内的四环素类呈高水平耐药。1～5号及9号CRKP菌株具有相同的耐药表型,而6～8号及10号CRKP菌株具有相同的耐药表型。见表1。

表110株CRKP菌株对抗菌药物的敏感结果

2.3碳青霉烯酶检测结果

10株CRKP菌株mCIM试验均阳性,eCIM试验均阴性。经赛沛试剂盒检测,均检出blaKPC碳青霉烯酶基因。

2.4MLST结果

CRKP7个管家基因的PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证结果如图1所示。PCR测序结果经DNAMAN比对、拼接,得到的序列上传到Pasteur中KPNMLST数据库进行比对分析,10株CRKP均为ST11型。

图1CRKP管家基因PCR扩增结果验证

2.5PFGE分型结果

10株CRKP菌株经XbaI酶剪切,PFGE后得到5种带型。其中2～5号及9号CRKP菌株电泳带型完全一致,结合MLST均为ST11型,考虑为同一来源,为流行菌株。1号CRKP菌株与流行菌株仅有1条条带的差异,两者亲缘关系接近。患者E标本中分离的6～8号和10号CRKP菌株有三种带型,与流行菌株条带相差3条以上,来自痰的6号和与来自血的10号菌株带型相同,但与同来自于痰的7号菌株带型不同。见图2。

图210株CRKPPFGE及聚类图

3、讨论

2018年CHINET细菌耐药监测网报道,在呼吸道分离的病原菌中,肺炎克雷伯菌已经超过鲍曼不动杆菌,跃居第一位,其在血等无菌体液的分离率也逐渐升高,仅次于大肠埃希菌,位于第二[3]。CRKP的分离率也居高不下,一项来自中国的多中心研究报道,在所有耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)分离株中,CRKP占73.9%,耐碳青霉烯类大肠埃希菌(16.6%)和阴沟肠杆菌(7.1%)次之;在所有住院患者中,CRE感染导致的病死率高达33.5%,而CRKP在血流感染和下呼吸道感染致死率则更高[4,5]。CRKP感染主要与肺炎克雷伯菌定植或感染病史、肠外营养,使用第三代头孢菌素或碳青霉烯类抗生素有关[6]。

CRKP致死率高的原因之一是对抗菌药物广泛耐药,文献[4,7]报道CRKP对头孢菌素类、喹诺酮类耐药率高达85%以上,对氨基糖苷类的耐药率较低,但也高达50%以上,而对革兰阴性菌感染治疗最后防线替加环素的敏感率仅有40.2%。本研究10株CRKP菌株中,6株对测试的所有抗菌药物均耐药。替加环素K-B纸片扩散法的抑菌圈仅有7mm,表现为高水平耐药。CRKP对碳青霉烯类耐药的重要机制为产KPC酶,与国内研究[8]一致,其对替加环素耐药机制可能与外排泵表达上调等有关[9,10]。

国内流行的CRKP主要为产KPC酶的ST11型[11,12],与本研究结果一致。但是不同医院CRKP的流行基因型不尽相同[13,14],研究CRKP的基因型别及同源性有助于监测医院感染及其发生路径,能为切断感染路径,控制医院感染提供依据。MLST和PFGE均可以用作细菌分型,且各有优劣。前者分辨率高,重复性好,数据可共享,可进行不同实验室间比对,但是测序成本高,分析缺少基因组详细信息或含有大量基因组岛插入序列,不能单独作为暴发溯源的工具;后者结果稳定,重复性好,可发现大片段的插入、缺失、重组等,酶切位点的点突变以及质粒的获得、丢失,但操作时间长,受人为影响因素大,分析的是条带而不是序列[15],通常推荐将二者结合起来进行同源性分析。

本研究中分离10株CRKP菌株的MLST均为ST11型,未表现出菌株间差异;而通过PFGE分型得到5种带型,其中11月22—28日分离的4株(2～5号)菌株带型与12月6日于气压治疗仪面板分离的CRKP(9号)完全一致。经调查该仪器为科室共用设备,考虑本事件为气压治疗仪为媒介的接触传播导致的医院感染,该结论也表明在研究医院感染阐明菌株同源性时PFGE是MLST的有力补充。2号和3号CRKP菌株分别分离自同一重症胰腺炎患者的腹腔引流液和血标本,其PFGE带型完全一致,推测CRKP可能通过腹腔感染入血;6～8号和10号CRKP菌株分别分离自另一患者的痰、痰、引流液和血标本,只有6号与10号菌株带型完全相同,推测CRKP是通过呼吸道感染入血,同样分离自痰的6号菌株与7号菌株同源性在85%以上,可能为变异株,而分离自分泌物的8号菌株带型差异大,亲缘关系较远。以上两组数据均表明PFGE在明确细菌感染路径方面的优势。值得注意的是分离自9月16日的1号菌株与本次医院感染流行株的克隆仅差异一条条带,Tenove等[16]认为由于细菌具有变异性,在PFGE图谱分析中,相似值在0.85以上的菌株可以判定为流行病学相关,由此可见本次流行菌株可能为1号菌株变异而来。

综上所述,PFGE在明确医院感染细菌传播路径,个体细菌感染路径以及遗传变异方面具有重要应用价值。杜小莉等[17]也认为PFGE在甄别暴发菌株、高度相关菌株和不相关菌株时有很好的甄别能力,并且分型结果与菌株分离病区、分离时间具有一致性。针对暴发流行菌株,PFGE能够将相同MLST型别的菌株聚成一簇。此外,本研究也从科室环境、患者自身等多个角度发现,采取有效消毒隔离措施的重要性,尤其是患者共用设备,更需严格消毒管理,通过切断感染路径即可有效控制医院感染的发生。

参考文献：

[11]刘婷婷,杜鸿,周惠琴,等.临床耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌分子流行病学特征研究[J].中国抗生素杂志,2018,43(11):1436-1442.

[12]张志军,鹿麟,牛法霞,等.耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制与分子流行病学特征[J].中国感染控制杂志,2018,17(9):759-763.

[15]杨晨,胡仁静,胡锡池,等.MLST在碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌分子流行病学分析中的应用[J].中华医院感染学杂志,2016,26(23):5514-5516.

[17]杜小莉,周海健.肺炎克雷伯菌脉冲场凝胶电泳分型能力评价[J].疾病监测,2015,30(11):969-975.

贺文芳,周柯,周磊,刘家云,马越云,闫沛,徐修礼,郝晓柯.MLST和PFGE在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌医院感染监测中的应用[J].中国感染控制杂志,2020,19(06):533-538.

基金:空军军医大学西京医院学科助推项目(XJZT18ML54).