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异常毒性检查对疫苗质量的安全性分析及问题探讨

2020-06-18 972 上传者：管理员

摘要：异常毒性检查一直是疫苗质量控制中涉及安全性的批放行检查项目，主要检查疫苗在生产过程中可能引入的外来污染物或疫苗成分降解在动物体内产生的非正常或毒性反应。目前，WHO或部分国家/地区药典标准对疫苗异常毒性检查进行了修订，引起国内外疫苗行业的广泛关注。

关键词：
安全性
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异常毒性检查
疫苗
破伤风
质量控制
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异常毒性检查一直是疫苗质量控制中涉及安全性的批放行检查项目，主要检查疫苗在生产过程中可能引入的外来污染物或疫苗成分降解在动物体内产生的非正常或毒性反应。目前，WHO或部分国家/地区药典标准对疫苗异常毒性检查进行了修订，引起国内外疫苗行业的广泛关注。本文就国内外异常毒性检查的建立及发展历程进行总结，并对现存问题进行探讨。

1、异常毒性检查方法的建立

异常毒性试验是1894年德国政府为检测白喉抗血清中防腐剂苯酚的含量而建立的小鼠安全性试验方法。由于防腐剂苯酚具有毒性，出于安全性考虑，必须严格控制制品中的苯酚浓度不能超过0.5%。研究者在建立检测苯酚浓度方法时，观察到小鼠对苯酚浓度十分敏感，给小鼠注射含苯酚的白喉抗血清后，含0.5%苯酚的抗血清使小鼠颤抖，而超过0.5%苯酚的抗血清使小鼠抽搐并死亡，由此可检测苯酚浓度是否超标，研究者据此首次建立了利用小鼠检测白喉抗血清中苯酚浓度的安全性试验。同样采用苯酚作为防腐剂的破伤风抗血清及细菌性疫苗（霍乱疫苗）也采用该试验控制苯酚的浓度。因此，小鼠试验成为检查防腐剂苯酚含量的标准试验。

1900年，在应用意大利米兰血清研究所的白喉抗血清进行治疗后，有超过18例患者感染破伤风并造成13例死亡。1901年，在美国圣路易斯1批白喉抗血清被破伤风毒素污染，造成20例儿童感染破伤风并有14例死亡。这两起事故发生后，德国1901年增加了豚鼠试验作为检测可能引入或污染破伤风杆菌或毒素的生物指示试验。随后许多国家也应用豚鼠试验进行安全性控制。豚鼠试验最初被当作白喉抗血清质量控制特有的安全性试验，但随后陆续用于其他抗血清及疫苗。

20世纪40年代，德国在制订针对疫苗的法规中首次提到包括豚鼠试验和小鼠试验的一种安全性试验，将以前两个独立的特殊安全试验组合为一个一般安全性试验，至此，正式建立了异常毒性检查。二战后，在制订WHO指南时第一次提到上述的异常毒性检查。此后，异常毒性检查被用在几乎所有人及兽用生物制品的规程中。

2、各国异常毒性检查的标准及发展

异常毒性检查用于检测生物制品中外源污染物，在以往各版《欧洲药典》和WHO生物制品技术指南文件中均有规定，WHO称为无害试验（innocuitytest）或异常毒性试验（testforabnormaltoxicity)[1]，《美国药典》34称为一般安全性试验（generalsafetytest)[2]，《中国药典》三部（2015版）及《欧洲药典》7.0均称为异常毒性检查（abnormaltoxicitytest)[3,4]。各国及WHO标准中异常毒性检查方法见表1，尽管在不同国家该项检查的名称略有不同，但除《中国药典》三部（2015版）设有动物空白对照、WHO不允许复试外，异常毒性检查方法基本相同。

异常毒性试验用于药品安全性质量控制数十年后，科学家开始对这项非特异性试验的科学性及理论基础进行讨论，并对试验数据进行回顾性分析。在讨论的过程中，多数学者认为在引入GMP之后，通过使用适当及严格的质量控制措施，异常毒性检查的相关性变得非常可疑，异常毒性试验数据回顾性分析的结果表明该试验不具有可重复性，试验结果不可靠，也不适用于预期目的[5]。随后，对异常毒性检查的修订经历了部分、有条件的取消及完全删除两个阶段。

表1各国异常毒性检查的试验设计

20世纪90年代，德国血清学研究所（PaulEhrlichInstitute,PEI）率先对异常毒性试验进行研究，通过调查问卷收集到的工业界和PEI积累的4367次异常毒性检查，结果全部合格，其中1.1%的试验经复试结果合格。在此项研究的基础上，德国于1995年11月对异常毒性检查进行修订，取消全部兽用制品、人用抗血清、免疫球蛋白及百白破类制品中的异常毒性检查，在其他制品标准中保留异常毒性检查但不作为批放行的检定要求[6]。但给全球市场提供疫苗的生产商，为满足WHO的建议和许多国家监管要求，仍执行异常毒性检查。继德国后，《欧洲药典》对异常毒性检查也做出了同样的修订。美国FDA允许基于生产工艺及质量控制监测豁免一般性安全性试验。WHO在连续的技术报告汇编（technicalreportseries,TRS）修订版中说明，如证明生产一致性已满足国家质量控制机构要求且实施了可靠的GMP，常规批放行可省略异常毒性检查。但异常毒性检查仍未彻底取消，WHO又规定若进行异常毒性检查，每批次均应符合异常毒性试验的要求[7,8]。

2015年，美国废止生物制品许可申请中要求的一般安全性试验法规[9]。此后进入了对异常毒性检查进行彻底删除的阶段。2018年6月，《欧洲药典》委员会在《欧洲药典》增补9.6版本中，完全删除了异常毒性试验，不但删除了通则2.6.9异常毒性检查这一章节，还删除了所有各论中的异常毒性检查项[10]。2018年10月，WHO生物制品标准化专业委员会在第69次会议上建议所有未来出版的TRS（包括建议、指南和手册）不继续收载无害试验（也称为异常毒性检查和一般安全性试验），并且忽略此前出版的TRS文件中的该项试验[11]。

3、异常毒性检查现存问题的讨论及建议

3.1试验用动物未标准化

国内外药典对异常毒性检查试验用动物的要求为健康合格的清洁级小鼠和豚鼠。有学者研究小鼠品系对异常毒性检查结果的影响，在试验过程中同一名试验者采用昆明小鼠及NIH小鼠对同一批样品进行检测显示，采用昆明小鼠检查结果合格而NIH小鼠却不合格，表明小鼠品系对异常毒性检查结果具有一定的影响[12]。因试验动物对试验结果的影响较为复杂多见，为提高异常毒性检查的可重复性，建议限定试验动物品系、性别及日龄等可能影响检测结果的因素。

3.2结果判定要求不具体

《中国药典》三部（2015版）对异常毒性检查结果判断标准为动物全部健存，到期体重增加且无异常发应。而对于动物异常反应的判断要求不明确，动物接受供试品注射后可能因供试品温度、pH或渗透压而发生一过性应激反应，对此是否归为异常反应，不同试验者因主观因素可能给出不同的判定结果。如小鼠在注射后出现短暂震颤的情况，有些试验者考虑动物为腹腔注射后腹膜刺激症状，与疫苗渗透压或佐剂有关，与毒性无关，若动物健存且体重增加应判为合格[13]，而有些试验者认为动物存在明显刺激症状应判定不合格，对于诸如此类的情况可考虑进一步明确合格的判定标准，如注射后是否设定一定时间内出现某些信号不记为异常、具体异常的体征或行动、动物摄食饮水的改变等。

3.3取消异常毒性检查的建议

随着国际上取消疫苗异常毒性检查，我国疫苗生产企业及部分学者也提出修订或取消异常毒性检查的意见。异常毒性检查经过一个多世纪的演变，由最初检验检测白喉抗血清中苯酚浓度的特异性试验到成为非特异性的安全性试验，再到部分取消甚至全部取消异常毒性检查项目，是与疫苗开发、生产工艺控制和污染物控制等方面的发展息息相关的。目前，在疫苗工艺开发及验证过程中，已对微生物污染或有机杂质残留等污染物及工艺杂质进行了研究，并通过一系列特定的经验证的检测进行控制，加上目前实施的包括良好GMP及全过程质量控制措施的制造工艺，已较好地保证疫苗质量和安全，用于检查疫苗在生产制造过程中引入的外来污染物或疫苗成分降解产生的非特异性毒性反应的异常毒性检查，对于确保药品的安全性及纯度失去了原有的意义。但鉴于异常毒性检查是关系到疫苗安全性的质量控制指标，为稳妥起见，建议收集整理各种疫苗既往异常毒性检查结果情况，进行回顾性分析，为修订或取消异常毒性检查提供依据。可根据不同疫苗检查结果的实际情况，分批分品种取消异常毒性检查。另外，在删除异常毒性试验的同时应考虑是否使用更加科学合理的特异性试验方法用于确保药品安全性。

参考文献：

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:1141.

[12]佟书莲,姚治,李君安,等.实验小鼠品系和饲养条件对异常毒性检查结果的影响[J].中国药事,1994,8(2):107-109.

[13]杨赟昀,胡宇驰,周建平,等.4种疫苗引起小鼠异常毒性检查中腹膜刺激症状的原因探讨[J].中国药房,2014,25(13):1169-1171.

王晓娟,赵勇,曹琰,郭中平.疫苗异常毒性检查及相关问题探讨[J].中国生物制品学杂志,2020,33(06):722-724.