衣原体（Chlamydiae）是一类严格真核细胞内寄生、具有独特发育周期的病原菌，从单细胞生物到人类均可受其感染，引起严重的临床症状。基于核糖体RNA(rRNA）基因的同源性，衣原体建立了独立的门、纲和目，衣原体目分为8个科和11个属；衣原体属包括沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）、肺炎衣原体（C.pneumoniae,Cpn）和鹦鹉热衣原体（C.psittaci,Cps）等12个种[1]；其中Ct感染可引发沙眼、生殖道感染以及性病性淋巴肉芽肿等疾病[2];Cpn可引起慢性感染，并与一系列慢性肺部疾病有关，包括哮喘、慢性支气管炎和慢性阻塞性肺疾病（COPD)[3];Cps主要感染动物，但可在人类中引起严重的人畜共患传染病。

衣原体疾病的预防和治疗，需要对其致病机制和毒力因子进行深入剖析，但衣原体分子遗传操作工具的缺乏一直是研究的一大阻碍。在过去的几年里，这种专性胞内病原菌的遗传分析系统取得了重大的进展，现代分子操作工具的发展从根本上改变了衣原体的研究格局。本文将综述衣原体基因组学研究所面临的挑战和目前已建立的遗传工具及其应用。

1、衣原体遗传操作面临的挑战

1.1衣原体独特的发育周期

衣原体在宿主细胞中的发育周期在原体(elementary body, EB)和始体(reticulate body, RB)之间交替[4];EB具有感染性，有细胞壁和致密的类核结构，稳定地存在于细胞外环境；RB是衣原体的繁殖形式，代谢活跃，不具有感染性。EB黏附在宿主细胞表面并诱导其内化是感染的第一步，由此产生含有EB的胞内囊泡(也称之为包涵体);内化后，包涵体内的EB分化成RB,RB则通过二分裂进行增殖，最终分化为EB,成熟的子代EB通过细胞裂解或“胞吐”外排等途径被释放到细胞外，开始新的感染[5]。

衣原体独特的发育周期给外源DNA的传递带来了挑战。进行遗传操作时虽可以针对EB或RB,但是RB存在于宿主细胞内，在细胞外极其不稳定，外源DNA需要通过四层膜(宿主质膜、包涵体膜和RB内外膜)才能到达细菌胞浆[6];而EB在外界环境中虽然可以稳定存在，但其细胞壁是一系列紧密交联的蛋白质，坚硬的细胞壁使得EB难以吸收大分子，从而限制了对外源DNA的摄取[7]。

1.2标记抗生素的选择转化

衣原体的阳性选择通常是通过抗药性标记进行的。在治疗衣原体感染性疾病时，抗生素被广泛应用于临床，这在一定程度上限制了适合转化研究的抗生素耐药标记物的使用。此外，由于衣原体存在于宿主细胞的包涵体中，用于标记的抗生素必须穿透至少两层脂质双分子层(细胞膜和包涵体膜),因此需要选择更高的抗生素浓度，而较高的MIC可能对宿主细胞产生毒性，这进一步地限制了标记抗生素的选择。目前，几种抗生素已成功用于衣原体的遗传选择，包括四环素、利福平、大观霉素、氯霉素等[8]。然而，衣原体抗生素耐药基因的突变通常呈隐匿性(如16S RNA、RpoB和GyrA),导致可选择标志物的使用有限[9]。

1.3转化子的克隆分离

衣原体与外源DNA共同孵育后，在抗生素存在的条件下，可以筛选出转化子；然而，克隆分离转化子必须尽快进行，以便最大限度地减少其他未转化细菌的携带潜力。衣原体与可以在琼脂平板上自由克隆分离的细菌不同，由于其专性细胞内存活的特性，通常采用空斑试验(plaque assay);这种方法通过在衣原体感染的单层细胞上铺加含有琼脂糖凝胶的培养液，使其只向邻近细胞扩散，在几轮感染后形成肉眼可见的空斑，空斑内的细菌可以从琼脂糖层中挑选出来，并进一步扩大[10]。但大多数衣原体临床分离株形成斑块的能力较差，对于只能在阿米巴宿主中繁殖的衣原体也无空斑试验分离克隆群的报道[11]。在这种情况下，有限稀释法、流式细胞术和显微操作器的使用[12],通常被用来分离感染细菌的细胞。

2、衣原体遗传操作的可行性

在过往的研究中发现，衣原体具有许多与DNA摄取、重组和修复有关的基因，可以实现种间和种内的侧向基因转移。20世纪90年代，在对编码主要外膜蛋白(MOMP)的ompA基因进行特异性序列分析时，第一次发现了Ct菌株内的基因重组[13]。随着全基因测序技术的出现，证明了在Ct进化过程中，整个基因组发生了重组事件[14]。2007年，Demars等[15]建立了体外侧向基因转移系统，用具有两种不同耐药性的Ct菌株同时感染宿主细胞，分离出双重耐药菌株的频率比单感染自发突变产生的菌株频率高104倍，表明不同血清型Ct之间可以发生体外基因重组。虽然缺乏可识别的结合机制、能力诱导基因或途径和限制修饰系统，很难确定衣原体DNA交换的机制，但这种“天然的能力”可以用来开发衣原体转化系统，为衣原体遗传操作的发展提供了更多可能性。

3、衣原体的分子遗传操作

3.1遗传转化

重组DNA的稳定转化，一直是衣原体分子遗传操作的最大障碍。1994年首次报道了衣原体的成功转化，Tam等[16]构建了含氯霉素抗性的穿梭质粒pPBW100,利用电穿孔技术将其导入到Ct的EB中，证明外源DNA可以通过电穿孔进入EB。2009年，电穿孔技术再次应用于大肠埃希菌pUC质粒对Cps 6BC的转化[17]。虽然这两项研究中的电穿孔条件相似，但其对EB活性的影响不同，可能与缓冲液的不同相关。尽管早期就完成了对衣原体的成功转化，但是电穿孔技术并没有成为当前衣原体转化实验的主流方法。Wang等[18]进行衣原体转化研究时，构建了携带有大肠埃希菌质粒和衣原体质粒的重组质pBR325::L2,将重组质粒和EB混合物 在CaCl2缓冲液中进行孵育，形成了含有内酰胺酶(Bla)和氯霉素乙酰转移酶(cat)基因的稳定转化子，进一步转化衣原体质粒缺失(plasmid-free)菌株，可以恢复Ct质粒操控糖原合成的能力，为衣原体基因功能的全面研究铺平了道路。基于CaCl2的化学转化可以产生稳定的转化子，目前已成为衣原体转化的首选技术，并且产生了具有多种不同抗生素耐药的穿梭质粒。电穿孔和CaCl2转化促进DNA进入EB,而在宿主细胞内复制的RB则通过树状大分子进行DNA转化；有研究开发了一种非细胞毒性纳米结构传递载体称为树状大分子(dendrimers),将其插入到pL2菌株中进行转化[19]。这种转化系统不涉及电穿孔或其他手段的感染细胞培养，使用少量的DNA复合物与树状大分子结合，就能产生与其一致的转化群体，同时也用于Cpn的转化[20],将有助于对该病原体的基因功能及致病机制的研究。衣原体的成功转化是其遗传操作发展史上的一个重要转折点，将加速我们对这些重要病原体生物学的理解。

3.2穿梭质粒载体

随着转化系统的发展，可用于衣原体研究的分子遗传工具库迅速扩大，具有多克隆位点(MCS)、荧光蛋白报告基因、诱导启动子和新的可选择标记的穿梭质粒载体产生。早期研究设计了两种穿梭质粒载体，基于Ct L2内源性质粒的pBR325::L2[21]和基于瑞典LGV L2临床分离株且携带CDS1(pgp7)缺失的pGFP::SW2[22],被用作质粒缺失Ct L2菌株的转化。穿梭质粒的研究中最引人注目的是增加了编码各种荧光蛋白基因，以便于对病原体进行活细胞成像。例如，穿梭质粒载体pBOMB4及其衍生物pBOMB4-MCI可分别表达绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(mCherry)[23],这为确认重组质粒在转化子中的存在和维持提供了一个方便的标记。另一个显著的进步是引入了四环素调节的控制元件，以精确地控制衣原体发育周期中不同时间的基因表达。Wickstrum等[24]的研究生成了一种新的穿梭载体pASK-GFP-L2,其GFP的表达受到四环素抑制剂和无水四环素的严格调控，表明代谢的多样性会影响GFP的诱导或表达，这些观察结果表明了该分子工具的具有强大潜力，使许多实验分析能够更好地阐释衣原体的生物学和发病机制。四环素诱导系统的应用对衣原体是有利的，因为四环素的衍生物，如脱水四环素，可以穿过生物膜，在对衣原体无毒的浓度下激活基因表达。大多数质粒载体均以β-内酰胺酶作为选择标记，而β-内酰胺类药物在临床上用于治疗孕妇的宫颈炎，因此该抗生素标记只用于Ct LGV型的遗传研究。对于其他衣原体的研究，将采用由替代的抗生素耐药标记产生的两个质粒。pGFPBSD/Z::SW2[25]是pGFP::SW2的衍生体，其中cat基因被杀虫素S脱氨酶基因(bsd)取代，携带该质粒的转座子可以用杀虫素来选择；另一个质粒载体pGFP-CAT::SW2[26]是通过从pGFP::SW2中删除β-内酰胺酶基因而得到的，可用作氯霉素选择。这些穿梭质粒的开发扩大了衣原体遗传的工具库，也适用于突变、基因过表达或条件表达，以及III型分泌效应因子[27]的研究。

3.3正向和反向遗传分析

衣原体的分子遗传研究遵循的策略方法是：从随机突变开始，然后筛选感兴趣的特定表型(正向遗传学)或携带特定基因改变(反向遗传学)的突变体。微生物基因组的随机突变方法多种多样，如插入转座子、紫外线照射和化学诱变等，其中转座子诱变技术成功应用于其他专性胞内病原菌[28],而衣原体的遗传变异需要依赖于化学诱变剂。将受感染的细胞暴露于甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone,EMS)或乙酰基亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)中，可产生零、条件、亚态和超形态等位基因[29],然后利用空斑试验分离克隆突变体。在描述衣原体反向遗传应用的第一份报告中(如图1所示),Kari等[30]使用低浓度的EMS诱导Ct,产生了每个基因组含有少于一个单核苷酸变异(SNV)的衣原体，结合错配特异性内切酶CEL I和定向诱导基因组局部突变技术(TILLING)对克隆株进行扩增和筛选，最后分离并鉴定了一个色氨酸合酶基因(trpB)的零突变体。随后的研究报道，对于分离筛选转录因子ChxR[31]、PmpD[32]和Pgp3[33]的零突变体，这种反向遗传性方法具有广泛的适用性。

图1反向遗传方法 

正向遗传学在微生物学领域有着悠久的历史，现在已被应用于几种衣原体功能的鉴定。Nguyue等[34]将化学诱变和全基因组测序(WGS)相结合(图2),利用衣原体菌株之间的侧向基因转移系统，产生了具有不同表型的衣原体突变株，研究证实了glgB突变和糖原沉淀物形成的联系并定义编码T2S中心成分的gspE在上皮细胞糖原积累和复制中的作用。利用正向遗传学进行筛选发现了衣原体多种功能因子，包括介导包涵体周围F-肌动蛋白组装细菌因子InaC[35]、干扰素抗性因子CpoS[36]和Igs4[37]、干扰素应激因子Ptr/CTL0175[38]以及温度敏感等位基因[39]。目前，化学诱变结合WGS或TILLING进行突变定位的方法是对衣原体进行全基因组分析的唯一策略。此外，由于这种方法不受DNA转化效率的限制，且随着全基因组测序成本的不断下降，这一策略显然适用于所有衣原体的遗传研究。

图2正向遗传方法 

通过化学诱变剂(EMS/ENU)对Ct RB进行突变以产生足够数量的突变体，将其置于96孔板中进行克隆，从每个池中Ct扩增出trpB操作子，CEL1酶切结合DNA凝胶电泳鉴定携带trpB突变的亚群，TILLING技术可以识别靶基因中的SNV,以筛选出含有靶基因突变的突变株。

通过化学诱变剂(EMS/ENU)对Ct RB进行突变产生利福平耐药的菌株，利用空斑试验分离出具有共同斑块形态的突变体，对其进行基因组测序以识别遗传损伤。为了建立基因损伤与特定斑块形态之间的联系，在利福平和大观霉素的存在下，用RifR突变体和野生型SpecR株感染HeLa细胞，选择重组RifR SpecR株。通过全基因组测序筛选出相关表型的突变株。

3.4靶向诱导基因

失活质粒转化方案的建立使基于质粒的衣原体染色体DNA靶向基因破坏方法的发展成为可能。目前，已经产生了三种针对衣原体基因失活的靶向方法：插入可移动的II型内含子(TargeTron)、荧光报告的等位基因交换突变(FRAEM)和CRISPR干扰(CRISPRi)。

3.4.1插入可移动的II型内含子(TargeTron)

TargeTon系统依赖于以原核基因组为靶点的可移动的第二组内含子，通过改变内含子底物识别区域内的DNA序列，可以被重新定向，以插入到特定的靶点。在衣原体的首次应用中，通过对质粒载体pACD4K-C进行修饰以引入bla基因，并用氨苄西林筛选到一个稳定的incA::GII(bla)突变体，这是衣原体中第一个位置特异性染色体基因失活[40]。随后，Lowden等[41]在Johnson等[42]的研究上利用氨基糖苷3′腺苷转移酶(aadA)基因创建了一个大观霉素可选择的GII内含子，然后使用GII(aadA)内含子和GII(bla)内含子创建了一个incA::GII (aadA),rsbV1::GII(bla)双突变体。TargeTron技术一直是在衣原体中使用最广泛的靶向基因破坏方法，现已被用于靶向基因失活、基因组编辑(通过Cre-lox系统[43])、遗传物质传递，以及对与染色体整合的单拷贝结构进行突变约束互补。

3.4.2荧光报告的等位基因交换突变(FRAEM)

衣原体遗传学研究进展迅速，但基因组修饰仅限于点突变和GII内含子插入，从而截断蛋白质产物，对基因缺失或更复杂的基因组整合(如等位基因交换)很难处理。Mueller等[44]开发了一种FREAEM的方法，使用条件自杀载体pSU6迫使片状染色体上的DNA同源区域之间进行重组，并引入了一个选择盒和双报告基因(bla和gfp),以促进重组体的鉴定。FRAEM载体上重组区内外的荧光标记基因允许对单交叉和双交叉(等位基因交换)事件进行视觉区分，因此该系统可用于产生基因的插入和缺失。然而，对于操纵子内基因的删除，该方法可能会对下游基因产生极性效应。Keb等[45]的研究解决了这一问题，将FRAEM介导的基因缺失与Cre-lox介导的选择盒切除结合起来，成功产生了一个无标记的tmeA缺失但对tmeB的表达没有负面影响。FRAEM/FLAEM[46]已成功地用于删除III型分泌因子的基因，如tmeA和tarp[47],为衣原体的毒力研究提供了一种有效的分子遗传操纵工具。

3.4.3 CRISPR

干扰(CRISPRi)最近一项新的技术被提出可以对衣原体基因组进行条件性敲除-CRISPR干扰(CRISPRi),是基于一种不具有催化活性的Cas9变体dCas9识别其同源gRNA并结合目标序列的能力；在可诱导启动子(gRNA通常具有组成性表达)的控制下，用dCas9编码载体转化感兴趣的生物体，通过诱导dCas9的表达来选择性地阻断目标序列的转录，该技术现已成功在大肠埃希菌[48]和结核分枝杆菌[49]中得到证实。在最初的研究中，Ouellette[50]选择incA作为设计靶点，将同时编码Sa_dCas9和靶向Sa_gRNA的质粒转化至Ct中，可观察到宿主细胞中RB表达的IncA显著性减少，表明构建的质粒载体抑制了衣原体中incA的表达。在对载体的稳定性进行了一些微调之后，Ouellette研究组随后使用CRISPRi生成了衣原体转化子来抑制CLpP2Xctr的表达，导致衣原体生长下降，并表明ClpX和ClpP2同源基因是Ct LGV正常发育所必需的[51]。CRISPRi成功地诱导抑制衣原体的靶向基因表达，进一步丰富衣原体的遗传工具库，可用于专性病原菌中必要基因功能的研究。

4、结语

衣原体的成功转化是其遗传学研究历史上具有里程碑意义的事件，为其他遗传方法和工具的开发应用提供了关键性的第一步。目前，衣原体的遗传操作工具层出不穷，但其中多数是针对于Ct的研究，限制了我们对衣原体发病机制关键方面的解剖，因此还需要开发新的遗传工具以扩展进其他衣原体种属。此外，随着衣原体工具箱的不断扩大，也将出现新的研究方向，例如选择适当的动物模型来测试转基因菌株的毒力，接种方式，以及使用适当的衣原体菌株。

参考文献:

[2]李鹏,端青,宋立华衣原体最新分类体系与分类鉴定方法研究进展1.中国人曾共事病学报,214-0(2)1262-1266.

基金资助:湖南省教育厅创新平台开放基金项目(No.18k072);

文章来源:李舒怡,陈超群.衣原体遗传操作的研究进展[J].中国病原生物学杂志,2023,18(10):1226-1230.DOI:10.13350