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基于代谢组学研究XLS对白色念珠菌的代谢变化及抑菌机制

2024-05-27 103 上传者：管理员

摘要：目的:血链球菌提取物XLS是从口腔血链球菌中提取的具有抑菌作用的胞内蛋白，本文通过非靶向代谢组学技术检测分析XLS作用于白色念珠菌所产生的代谢变化，并初步分析其作用机制。方法:(1)非靶向代谢组样本制备：实验组：0.5 mg/mL XLS与白色念珠菌共培养12 h对照组：单纯白色念珠菌培养12 h,每组6个生物学重复。(2)利用非靶向代谢组学技术对两组样本进行代谢变化研究，运用多变量分析[主成分分析(principal components analysis, PCA)和偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)]和单变量分析(t检验)比较两组样本之间的差异。结果:PLS-DA和PCA分析结果显示两组样本差异性显著。本研究筛选出160个正离子差异代谢物，其中68个代谢物上调，92个代谢物下调；90个负离子差异代谢物，其中52个代谢物上调，38个代谢物下调。通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析发现，富集显著的通路主要包括抗坏血酸与醛酸代谢通路、氨基酸合成、嘌呤嘧啶代谢通路。此外，还发现了一些与氧化应激反应相关的代谢物，与对照组相比，其在实验组均表达上调。结论:(1)XLS对白色念珠菌的氨基酸代谢、脂质代谢、嘌呤嘧啶代谢等过程产生显著影响；(2)XLS可能通过引起白色念珠菌菌体的氧化应激反应导致白色念珠菌细胞的氧化损伤，从而抑制白色念珠菌的生长繁殖。

关键词：
XLS
差异代谢物
白色念珠菌
真菌感染
非靶向代谢组
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真菌感染发病率在人群中逐年升高，对人类健康已构成威胁，其中白色念珠菌是人类最常见的真菌病原体之一[1]。在过去的二十年里，白色念珠菌已经成为一个主要的公共卫生难题。白色念珠菌可以引起皮肤黏膜及体内的感染。尤其是白色念珠菌导致的院内感染具有很高的发病率和死亡率[2,3]。血链球菌提取物XLS是从口腔血链球菌中提取的具有抑菌作用的胞内蛋白。前期研究表明，XLS对白色念珠菌及生物膜均有明显的抑制作用[4]。XLS能够使白色念珠菌的细胞膜通透性增加，疏水性减少，并导致其超微结构和形态学的改变[5]。此外，XLS还能够减少白色念珠菌细胞的粘附力和杨氏模量[6]。但是XLS对白色念珠菌的抑菌机制的研究尚未明确。

非靶向代谢组学技术可以对生物系统中代谢物的定性和定量组成进行研究，并检测生物途径的细微变化，从而深入了解各种生理条件和异常过程的机制[7]。本研究利用非靶向代谢组学技术，分析XLS对白色念珠菌代谢方面的影响，并从相关的代谢异常入手初步探讨其可能的作用机制。

1、材料与方法

1.1 菌种和培养基

从临床上分离的血链球菌菌株(Streptococus sanguis,S.s)和白色念珠菌(Candida albicans,C.a)ATCC10231购于河南北纳生物。血琼脂平板、念珠菌显色培养基、沙氏葡萄糖液体培养基(sabouraud dextrose broth, SDB)、脑心浸出液培养基(brain heart infusion, BHI)。

1.2 主要仪器和设备

恒温培养箱、低温高速离心机(BY-LR21)、超声细胞破碎机(宁波新芝生物科技有限公司SCIENTZ-11D)、麦氏比浊仪(PhoenixSpec)、除菌滤膜(BEKMAN Sterile Syringe Filter PES Membrance 0.22 μm 25 mm)、固体硫酸铵。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株复苏以及XLS的提取

XLS由黑龙江省医院提供，并已验证具有显著抑菌活性。提取方法为恒温厌氧培养48 h的菌悬液于4 ℃,12000 g离心30 min, 去除上清液，反复洗涤3次，再经超声破碎，盐析，除盐透析浓缩等步骤，冻干得到XLS[4]。

1.3.2 非靶向代谢组代谢物提取

样本制备：将12个试管分为两组，每组6个。分别为对照组(Ca组)和实验组(XLS.Ca组)。将过夜培养的白色念珠菌用SDB培养基稀释配成5×106 CFU/mL的菌悬液，并分别置于12个试管中。实验组加入终浓度为0.5 mg/mL的XLS,对照组加入等量磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)。37 ℃培12 h后离心收集菌体，用预冷的PBS洗涤2次，离心后将上清完全弃去，收集菌体并液氮速冻，之后转入-80 ℃保存。将每样本中取出10 μL混合成为质量控制(quality control, QC)样本，每样本加入1 mL预热的提取试剂，震荡后液氮速冻超声低温孵育1 h以上，随后冷冻离心取上清。

1.3.3 液相色谱-质谱联用仪(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS)检测

仪器参数(1)色谱条件：色谱柱：Hypesil Gold column(C18),柱温：40 ℃,流速：0.2 mL/min, 正模式：流动相 A:0.1%甲酸，流动相 B:甲醇，负模式：流动相 A:5 mmol/L醋酸铵(pH 9.0),流动相 B:甲醇，洗脱梯度设置为：初始1.5 min为2%B,1.5～3 min为2%～85% B, 3～10 min为85%～100%B, 10.1～12 min为2%B。(2)质谱条件：扫描范围选择m/z 100～1500;ESI 源设置：喷雾电压：3.5 kV;鞘气流速：35 psi; 辅助气流速：10 L/min; 离子传输管温度：320 ℃;离子导入射频电平：60;辅助气加热器温度：350 ℃;极性：positive, negative; MS/MS二级扫描为数据依赖性扫描。

1.3.4 数据预处理和代谢物鉴定

使用CD 3.1搜库软件处理下机数据，对每个代谢物进行简单筛选，分子式预测并与mzCloud、mzVault和Masslist数据库进行比对。用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)数据库、HMDB数据库、LIPIDMaps数据库对鉴定到的代谢物进行注释。使用metaX对数据进行转换后进行主成分分析(principal components analysis, PCA)和偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA),进而得每个代谢物的VIP值。基于t检验来计算各代谢物在两组间统计学差异(P值),并计算代谢物在两组间的差异倍数(fold change, FC)。

2、结果

2.1 图1所示QC样本相关性好，检测过程稳定性高，数据可靠。

2.2 对两组样本进行PCA分析(图2)可以看出组内样本差异性较小，两组样本差异性显著。PLS-DA分析(图3),不同模式下实验组与对照组均明显分离。实验组在左侧，对照组在右侧，正负离子模式下R2Y均大于Q2Y(正离子模式R2Y:0.99,Q2Y:0.94,负离子模式R2Y:1.00,Q2Y:0.92)模型建立良好。而且R2和Q2接近于1说明模型稳定可靠。对模型进行排序验证(图4),结果显示R2>Q2数据且Q2回归线与Y轴截距小于0时，表明模型未“过拟合”说明模型能较好地描述样本，可以用来后续分析。

图1 QC样本相关性

图2 PCA分析

2.3 差异代谢物的筛选设定阈值为VIP>1.0,FC>1.5或FC<0.667且P<0.05,筛选出差异代谢物。其中正离子模式下筛选出160种差异代谢物，其中68种上升，92种下降。负离子模式下筛选出90种差异代谢物，其中52种上升，38种下降。并对其进行分类主要包括：氨基酸及多肽、脂类和类脂质样分子，核苷，核苷酸类似物，碳水化合物等。为了观察代谢物的整体变化和整体分布，绘制了差异代谢物火山图(图5)。本文讨论的差异代谢物如表1所示。

图3 PLS-DA得分图

图4 PLS-DA 模型检验图

表1 关键差异代谢物分析表

氨基酸类物质变化最明显，其中L-天冬酰胺、D-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、S-腺苷蛋氨酸等明显表达下调，瓜氨酸、鸟氨酸、D-脯氨酸等明显表达上调。其中变化最明显的是瓜氨酸。碳水化合物类中葡萄糖-6-磷酸、甘露糖6磷酸明显表达上调，其中葡萄糖-6-磷酸变化最明显。核苷酸类物质尿苷二磷酸、二磷酸鸟嘌呤核苷、腺苷5’-二磷酸、胸苷5’-单磷酸盐、胸苷5’-二磷酸均表达上调，腺苷、腺嘌呤表达下调，其中胸苷5’-单磷酸盐上调最明显，腺苷下调最明显。脂类物质大部分表达下调，其中溶血磷脂酰胆碱类、溶血磷脂酰乙醇胺类、磷脂酰胆碱类均表达下调。

图5 差异代谢物火山图

此外，还发现海藻糖、3-硝基酪氨酸、2-羟基丁酸、硫辛酸、蛋氨酸亚砜、乙酰半胱氨酸、抗坏血酸、8-异-15-酮前列腺素F2α增多，其中海藻糖、硫辛酸、乙酰半胱氨酸氨酸、抗坏血酸均有抗氧化的功能，而2-羟基丁酸、3-硝基酪氨酸、蛋氨酸亚砜则涉及氧化损伤[8,9,10,11,12,13,14]。这几种物质的变化可能与XLS作用导致白色念珠菌的氧化应激反应有关。

2.4 KEGG富集分析通过筛选到相关富集通路，并根据P值大小制作了TOP20 KEGG气泡图(图6)。正离子模式下富集的通路包括氨基酸的生物合成、嘧啶代谢、色氨酸代谢、代谢途径、嘌呤代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等。负离子模式下富集的通路包括抗坏血酸与醛酸代谢、氨基酸糖和核苷酸糖代谢、精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、抗生素的生物合成等。这说明XLS可能对白色念珠菌氨基酸合成和代谢、嘌呤嘧啶代谢产生了一定的影响。

3、讨论

本研究中共鉴定出250种差异代谢物。这些代谢物涉及白色念珠菌氨基酸合成，嘌呤、嘧啶和脂质代谢，糖代谢。

图6 KEGG富集分析气泡图

3.1 XLS对氨基酸类物质代谢的影响

与对照组相比，上调最明显的氨基酸是瓜氨酸。瓜氨酸是精氨酸合成代谢途径的中间产物，有研究表明白色念珠菌在轻度氧化应激和亚致死浓度活性氧下会诱导精氨酸合成途径的表达上调[15]。此外，瓜氨酸可以由精氨酸代谢而来，并伴有NO产生。当超氧化物增加时，NO会和超氧化物反应生成强氧化剂过氧亚硝酸盐，并产生3-硝基酪氨酸。有趣的是，实验组的3-硝基酪氨酸表达也发生了上调，3-硝基酪氨酸是一种氧化应激的生物标志物，说明XLS可能引起了白色念珠菌的氧化应激，并引发了上述反应[16,17,18,19]。

与对照组相比，实验组谷氨酰胺表达下调。谷氨酰胺可以保护细胞正常生长代谢，它不仅是蛋白质合成的前体，还有维持细胞稳态的作用。谷氨酰胺的下调不利于白色念珠菌生长繁殖[20]。实验组S-腺苷同型半胱氨酸、S-腺苷蛋氨酸、S-(5-腺苷)-L-同型半胱氨酸均减少，它们是甲硫氨酸循环的中间产物。这表明XLS导致白色念珠菌甲硫氨酸循环受阻。而甲硫氨酸循环为DNA、多胺、氨基酸、肌酸和磷脂的合成提供一碳单位。其中S-腺苷甲硫氨酸是氨基丙基和甲基供体，也可作为DNA、相关蛋白质和RNA甲基化的主要底物[21]。这表明XLS了扰乱甲硫氨酸循环从而影响白色念珠菌核酸和蛋白质的合成。

3.2 XLS对脂质类物质代谢的影响

与对照组相比，脂质类物质溶血磷脂酰胆碱、血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱表达下调，而这些物质是构成细胞膜的基本成分[22,23]。这可能是XLS导致白色念珠菌细胞膜通透性改变的原因。

3.3 XLS对嘌呤嘧啶及糖代谢的影响

与对照组相比腺嘌呤、腺苷下调、葡萄糖-6-磷酸、核酮糖5磷酸、α酮戊二酸等物质的上调，提示 XLS影响白色念珠菌正常的嘌呤、嘧啶代谢和糖代谢。

3.4 XLS对氧化和抗氧化物质的影响

此外我们还发现一些氧化剂和抗氧化剂的增多，其中包括海藻糖、8-异-15-酮前列腺素F2α、蛋氨酸亚砜。白色念珠菌在热和氧化应激条件下，海藻糖合成会增多，以此来适应这些刺激[8]。8-异-15-酮前列腺素F2α是8-异前列腺素F2α的代谢产物，而8-异前列腺素F2α是非特异性脂质过氧化的前列腺素样产物[24]。这表明XLS可能会导致白色念珠菌脂质的氧化。蛋氨酸亚砜是蛋氨酸氧化产生的，其水平取决于细胞的氧化还原状态，通常在氧化应激、衰老等条件下升高[25]。这说明XLS可能引起白色念珠菌的氧化应激反应，从而使氧化和抗氧化作用失衡，造成白色念珠菌细胞的损伤。

3.5 结论

根据途径富集结果和差异代谢物分析可知：(1)XLS对白色念珠菌氨基酸合成与代谢、嘌呤嘧啶代谢、脂质代谢等过程产生显著影响。(2)XLS可能通过引起白色念珠菌的氧化应激反应导致白色念珠菌细胞的氧化损伤，从而抑制白色念珠菌正常的生长繁殖。此外，部分代谢组变化的功能尚不清楚，仍有待深入研究。

参考文献:

[4] 吴音璇,马晟利,葛文玉,等.血链球菌细菌素对伴放线聚集杆菌和白色念珠菌生物膜作用的研究[J].口腔医学研究,2020,36(4):360-364.

文章来源:代浩然,马晟利,韩烨,等.基于代谢组学研究XLS对白色念珠菌的代谢变化及抑菌机制[J].口腔医学研究,2024,40(05):407-412.