《中国心血管健康与疾病报告2021》研究显示冠心病发病率和死亡率仍呈逐年上升的趋势[1]。虽然冠心病二级预防已取得显著成效，但冠心病病人血运重建后5年不良心血管事件发生率仍可达20%[2]。动脉粥样硬化斑块破裂或侵蚀，继发血栓形成，致冠状动脉管腔狭窄或闭塞，是急性心肌缺血的主要病理机制。稳定性斑块向不稳定性斑块发展继而诱发冠状动脉血栓形成是一个动态的、多因素参与的复杂病理过程，涉及血小板活化、内皮损伤、凝血-纤溶功能失衡、炎症反应、脂质代谢紊乱等多个环节。因此，探索冠心病疾病进展相关基因，对于开展冠心病预后生物标志物研究及冠状动脉血栓形成的机制研究具有重要意义。

冠心病属于中医学“胸痹”“真心痛”范畴，心血瘀阻是疾病发生发展的核心机制。现代研究发现，血瘀证与血液流变性改变、血液黏度增加、微循环障碍及凝血/纤溶失衡等相关[3]。因此，临床多采用活血化瘀中药治疗冠心病。冠心Ⅱ号方是治疗冠心病血瘀证的代表方，由丹参、川芎、赤芍、红花、降香组成。临床研究已证实，冠心Ⅱ号方治疗冠心病疗效显著，可明显增加冠状动脉血流量，降低全血低切黏度，降低血清胆固醇和低密度脂蛋白水平，提高冠心病病人的生活质量，改善预后[4,5]。《急性心肌梗死中西医结合诊疗专家共识》《冠心病稳定型心绞痛中医诊疗专家共识》推荐冠心Ⅱ号方适用于瘀血内阻型者[6,7,8,9]。相关机制研究表明，冠心Ⅱ号方具有保护血管内皮、抑制炎症反应、抑制血小板活化等作用[10,11]。然而，冠心Ⅱ号方在冠心病二级预防中的作用机制尚不完全清晰。因此，本研究通过分析急性心肌梗死(AMI)病人与稳定型冠心病(SCAD)病人之间的差异基因，筛选疾病进展相关的基因，并结合网络药理学预测冠心Ⅱ号方干预冠状动脉血栓事件发生的作用靶点。

1、资料与方法

1.1 基于差异表达分析筛选冠心病疾病进展相关基因

从NCBI-GEO数据库中下载AMI病人与SCAD病人转录组表达谱GSE59867,该数据集由Maciejak等提交，采用Affymetrix公司提供的GPL6244基因芯片平台，共包含436例外周血单个核细胞样本转录组数据，其中111例为AMI病人入院当天采集的外周血样，46例为SCAD病人的外周血样。本研究纳入157例样本(AMI 与SCAD)进行差异分析和加权基因共表达网络分析(WGCNA),获得疾病进展相关基因。应用R 3.6软件中“limma”包分析AMI和SCAD之间差异表达基因(DEGs),设置DEGs的筛选标准为：校正后P<0.05,且|log2FC|>0.5,利用“ggplot2”包绘制DEGs的火山图。

1.2 基于WGCNA筛选冠心病疾病进展相关基因

WGCNA是一种分析基因关联模式的系统生物学方法，通过计算基因之间的相关系数，构建无尺度网络，寻找协同表达的基因模块，探索基因模块与临床表型的关联以及网络中的枢纽基因[12]。本研究利用R 3.6软件中的“WGCNA”包完成加权共表达网络的构建，识别疾病进展相关基因模块。通过加权的相关系数计算基因与基因的相关性，构建表达谱基因的邻接矩阵，计算节点间的相异度，将邻接矩阵转换为拓扑矩阵；使用动态剪切树算法对基因拓扑矩阵进行聚类，识别网络模块；通过Pearson相关分析计算模块与疾病的关联性，识别与疾病进展相关性最强的基因模块；最后，通过计算模块显著性(MS),与模块内的平均基因显著性(GS),筛选模块中的关键基因。

1.3 基因本体(GO)功能与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

利用R 3.6软件中“BiocManager”“clusterProfiler”“pathview”等安装包进行GO功能和KEGG通路分析，分别对DEGs和疾病相关模块进行功能注释，探讨疾病进展相关基因可能参与的病理环节。

1.4 冠心Ⅱ号方活性成分与药效靶点的筛选

检索中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库(https: //old.tcmsp-e.com)[13]收集冠心Ⅱ号方主要活性成分。根据药代动力学属性，设置口服生物利用度(OB)>30%和类药性(DL)>0.18,筛选有效活性成分。利用TCMSP数据库获得药效成分潜在的作用靶点，并在UniProt数据库将药物靶点进行规范矫正，获得与疾病靶点对应的基因名。

1.5 中药有效成分-疾病靶点网络构建

取DEGs与AMI相关模块基因的交集基因作为冠心病进展相关基因。利用R 3.6软件中的“VennDiagram”包，取冠心病进展相关基因与冠心Ⅱ号方药效靶点的交集，交集基因能够提示冠心Ⅱ号方在冠心病二级预防中防治冠状动脉血栓事件发生的潜在作用靶点。利用Cytoscape 3.8.0软件将药物化学成分-作用靶点的关系网络可视化展示。

2、结果

2.1 基于差异表达分析的冠心病疾病进展相关基因识别

根据DEGs筛选标准，从GSE59867芯片表达谱中共获得166个差异表达mRNA,其中上调基因81个，下调基因85个。详见图1。差异倍数较大的基因(log2FC>1)包括细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)、嗜酸性粒细胞阳离子相关蛋白(ECRP)、染色质蛋白(HP)、水通道蛋白9(AQP9)。

图1 AMI与SCAD差异表达基因火山图  

2.2 基于WGCNA的冠心病疾病进展相关基因模块识别

利用WGCNA包中的“pickSoftThreshold”函数筛选软阈值，无尺度拟合指数R2=0.9时，选取软阈值β=16,构建出的网络符合无尺度标准。基于动态剪切树的算法，设置最小模块的基因数目为20个，模块相似度大于0.75,绘制分层聚类树，最终获得14个模块，分别用不同颜色表示，其中Grey模块代表未被聚集归类的基因(见图2)。基于Pearson相关性分析方法，计算不同模块与疾病之间的相关性。详见图3。模块Black(515个基因)与AMI显著相关(r=0.58,P<0.05),提示模块Black可能与冠心病疾病进展相关。根据GS值筛选Black模块中的关键基因，前10个关键基因分别是肿瘤坏死因子受体超家族成员10D(TNFRSF10D)、脱唾液酸糖蛋白受体2(ASGR2)、极长链酰基辅酶A脱氢酶(ACADVL)、α-1,3-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(GBGT1)、AQP9、肥大细胞表达膜蛋白1(MCEMP1)、S100钙结合蛋白A9(S100A9)、SOCS3、STAB1、黄素还原酶(BLVRB)。

图2 基因共表达网络分层聚类树与共表达模块   

图3 共表达模块与临床表型的相关性  

2.3 DEGs与Black模块的功能和通路富集分析

对DEGs进行GO和KEGG富集分析，探讨其在冠心病疾病进展过程中参与的生物学过程及信号通路。GO富集分析结果显示，DEGs显著富集于碳水化合物结合(carbohydrate binding)、MHC蛋白复合物结合(MHC protein complex binding)、RAGE受体结合(RAGE receptor binding)、cargo受体激活(cargo receptor activity)等生物学过程。KEGG通路富集分析显示，DEGs主要富集于抗原处理和呈递(antigen processing and presentation)、自然杀伤细胞介导的细胞毒性(natural killer cell mediated cytotoxicity)、造血细胞谱系(hematopoietic cell lineage)等通路。详见图4、图5。这些结果表明DEGs主要通过调节免疫反应，参与冠心病疾病进展。

图4 DEGs的GO功能富集分析   

图5 DEGs的KEGG富集分析   

对Black模块进行功能注释和通路富集分析，Black模块主要富集于Toll样受体结合(Toll-like receptor binding)、脂肽结合(lipopeptide binding)、超氧化物生成NADPH氧化酶活化剂活性(superoxide generating NADPH oxidase activator activity)、低密度脂蛋白颗粒受体活性(low-density lipoprotein particle receptor activity)等生物学过程。KEGG富集分析结果显示，Black模块富集于中性粒细胞胞外陷阱形成(neutrophil extracellular trap formation)、FcγR介导的吞噬作用(Fc gamma R-mediated phagocytosis)、脂质和动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、B细胞受体信号通路(B cell receptor signaling pathway)、糖解与糖代谢合成(glycolysis/gluconeogenesis)等信号通路。详见图6、图7。这些结果表明Black模块主要通过调节免疫反应、糖脂代谢、氧化应激等参与冠心病疾病进程。

图6 Black模块内基因的GO功能分析   

图7 Black模块内基因的KEGG富集分析   

2.4 冠心Ⅱ号方活性成分与药物靶点的筛选

从TCMSP数据库中获得丹参活性成分65种、川芎活性成分7种、赤芍活性成分29种、红花活性成分22种、降香活性成分37种。获得丹参作用靶点140个、川芎作用靶点30个、赤芍作用靶点102个、红花作用靶点222个、降香作用靶点84个，经合并、去重、UniProt数据库规范后，共获得冠心Ⅱ号方的药效靶点224个。

2.5 冠心Ⅱ号方干预疾病进展的潜在作用靶点

将DEGs与Black模块取交集，获得64个交集基因，这些基因可能在冠心病疾病进展过程中发挥关键作用(见图8)。将冠心Ⅱ号方药效靶点与疾病进展关键基因取交集，获得冠心Ⅱ号方干预冠心病进展的潜在作用靶点。冠心Ⅱ号方可能通过作用于过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)、单核细胞分化抗原CD14(CD14)和细胞色素P4501b1(CYP1B1)在冠心病二级预防中发挥作用，其中，作用于PPARG的中药成分最多。详见图9。

图8 DEGs与Black模块基因韦恩图  

图9 冠心Ⅱ号方药物成分与作用靶点网络图  

3、讨论

动脉粥样硬化斑块破裂、血栓形成是急性心血管事件的主要病理基础，因此，稳固斑块、预防血栓形成是冠心病二级预防的关键。易损斑块与冠状动脉血栓形成涉及血小板活化、内皮损伤、凝血-纤溶功能失衡、炎症反应等多个病理环节，然而调控的关键基因尚不明确。本研究通过分析AMI病人和SCAD病人外周血单个核细胞的基因表达谱，筛选出与冠心病进展相关的基因，这些基因可能参与易损斑块破裂或侵蚀及继发血栓形成，是急性冠状动脉血栓事件的潜在干预靶点。

本研究通过对GSE59867数据集中AMI病人和SCAD病人转录组表达谱进行差异表达分析和WGCNA,筛选获得64个冠心病进展相关的关键基因，其中，SOCS3、ECRP、AQP9差异倍数较大，ASGR2、MCEMP1、S100A9、STAB1、BLVRB等是Black模块中的关键基因，显著与AMI相关。本研究结果显示，与SCAD病人相比，AMI病人SOCS3基因表达水平显著上调，这与既往的研究结果[14]一致。SOCS3主要通过抑制酪氨酸蛋白激酶(JAK)-信号转导与转录活化因子3(STAT3),参与炎症反应、细胞凋亡的负反馈调节[15,16]。刘金平等[17]发现上调血管平滑肌细胞SOCS3的表达可抑制STAT3的激活与磷酸化，以降低白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等细胞因子的表达水平，抑制炎症反应。AMI病人体内SOCS3基因表达升高是急性期炎症反应增强的结果，SOCS3可作为冠心病进展相关的候选炎症标志物及治疗靶点。ECRP是嗜酸性粒细胞活化后所释放的强碱性颗粒蛋白，能够反映嗜酸性粒细胞的活化程度，具有很强的细胞毒性，可促进TNF-α的表达，增强炎症反应，诱导细胞凋亡[18]。Jiang等[19]在AMI病人的冠状动脉血栓中发现嗜酸性粒细胞浸润，表明嗜酸性粒细胞的活化与血栓形成有关。此外，研究发现，ECRP表达水平与冠心病病人不良心血管事件风险相关，可作为冠心病预后的生物标志物[20,21,22]。然而，关于ECRP在易损斑块和血栓形成中的作用机制研究较少，成为未来进一步研究的方向。ASGR2的生物功能主要与代谢相关，参与脂肪酸氧化、脂类合成与代谢、蛋白质糖基化等过程。S100A9是一种钙结合蛋白，主要在髓样细胞内大量表达，也可在炎症、氧化应激等刺激后的非髓系细胞中表达。在细胞内，S100A9通过与Ca2+结合调节p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，引起白细胞迁移[23]。在细胞外，S100A9对炎性细胞具有很强的趋化活性，通过增强粒细胞集落刺激因子的合成，促进中性粒细胞和单核细胞募集[24]。S100A9还通过上调内皮细胞表面黏附分子表达促进单核/巨噬细胞与内皮细胞之间的黏附，通过增强血管通透性促进单核/巨噬细胞跨内皮迁移[25,26]。关于MCEMP1、STAB1和BLVRB在冠心病进展中作用机制的研究，文献报道较少，或可成为未来研究的新方向。

冠心Ⅱ号方是郭士魁名老中医和陈可冀院士等研制的治疗冠心病的代表方药，全方由丹参、川芎、赤芍、红花、降香五味药配伍组成，共奏活血化瘀、理气通络之效。高会丽等[27]研究发现，冠心Ⅱ号可减少犬急性心肌梗死范围、增加冠状动脉血流量，具有抗心肌缺血的作用。Zhao等[28]发现冠心Ⅱ号方可抑制大鼠缺血/再灌注模型心肌细胞凋亡，具有保护心肌细胞的作用。张梅等[29]发现冠心Ⅱ号可降低动脉粥样硬化大鼠血清总胆固醇、TNF-α、血栓素B2(TXB2)等因子水平。此外，冠心Ⅱ号还具有抗氧化、抗血小板聚集等作用[11]。然而，冠心Ⅱ号方的基础研究主要是药效研究，相关作用机制研究较少，尤其是在动脉粥样硬化斑块进展方面。因此，本研究应用网络药理学，预测冠心Ⅱ号方干预冠心病疾病进展的作用靶点，潜在的作用靶点包括PPARG、CD14和CYP1B1。PPARG是调控炎症反应的关键因子，具有抑制炎症反应、调控糖脂代谢等作用[30,31,32]。敲除小鼠体内PPARG基因后，白细胞介素(IL)-1、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子表达显著上调[33]。既往研究显示，PPARG通过抑制核转录因子-κB(NF-κB)和c-Jun 氨基末端激酶(JNK)的活性，降低下游炎性因子的释放，从而缓解机体炎症反应[34,35]。CD14属于细胞表面糖蛋白，是脂多糖(LPS)的重要受体，主要由单核/巨噬细胞产生。CD14在人体内有两种存在形式：一种是位于单核细胞表面的膜结合型CD14,通过与LPS结合刺激单核/巨噬细胞产生TNF-α、IL-1、IL-6等致炎因子[36];另一种是游离于血清中的可溶性CD14。朱京伟等[37]发现AMI病人血清可溶性CD14水平显著高于不稳定型心绞痛病人，而不稳定型心绞痛病人CD14水平又高于稳定型心绞痛病人，提示CD14与冠心病疾病进展相关，血清可溶性CD14水平的高低可反映冠心病的病变程度。CYP1B1是一种细胞色素P450单加氧酶，参与各种内源性底物的代谢，包括脂肪酸、类固醇激素和维生素[38]。赵丽华等[39]发现，CYP1B1基因敲除可缓解小鼠高脂饮食诱导的肝脏组织巨噬细胞浸润，抑制炎性因子的表达，改善胰岛素抵抗。炎症反应贯穿动脉粥样硬化斑块的发生发展，炎症反应加剧是稳定性斑块向不稳定性斑块发展的启动机制。结合文献分析，本研究推测冠心Ⅱ号可能通过作用于PPARγ、CD14和CYP1B1抑制炎症反应，从而在冠心病二级预防中发挥作用。

4、小结

综上所述，本研究通过生物信息学分析结合既往文献报道，筛选获得冠心病疾病进展相关基因，这些基因主要与炎症反应、糖脂代谢有关，为易损斑块、冠状动脉血栓形成相关的机制研究提供新思路。本研究还通过网络药理学分析获得冠心Ⅱ号方干预冠心病疾病进展的潜在靶点，为冠心Ⅱ号方相关分子机制研究指出了新方向。

参考文献:

[1]中国心血管健康与疾病报告编写组.中国心血管健康与疾病报告2021概要[J].中国循环杂志,2022,37(6):553-578.

[3]陈可冀,史大卓,徐浩,等.冠心病稳定期因毒致病的辨证诊断量化标准[J].中国中西医结合杂志,2011,31(3):313-314.

[4]徐睿,黄熙,李源,等.冠心Ⅱ号治疗冠心病心绞痛的临床观察[J].成都中医药大学学报,2001,24(4):17-19.

[5]甘洪全,黄熙,田新桥,等.冠心Ⅱ号汤剂对健康男性冠脉血流和心脏收缩舒张功能的影响[J].中国中西医结合杂志,2004,24(9):785-789.

[6]黄慧明,张涛.精制冠心片在不稳定性心绞痛治疗中的应用价值及对miR-143及miR-145表达的影响分析[J].解放军预防医学杂志,2020,38(3):81-83;87.

[7]李黔云,万启南,段艳蕊.冠心Ⅱ号方治疗冠心病稳定性心绞痛临床观察[J].云南中医中药杂志,2015,36(8):30-31.

[8]中华中医药学会心血管病分会.冠心病稳定型心绞痛中医诊疗指南[J].中医杂志,2019,60(21):1880-1890.

[9]陈可冀,张敏州,霍勇.急性心肌梗死中西医结合诊疗专家共识[J].中国中西医结合杂志,2014,34(4):389-395.

[10]黄熙,赵健蕾,张红敏,等.冠心二号方剂对健康人冠脉血流量的影响以及对大鼠心肌缺血再灌注模型抗心肌细胞凋亡的作用[J].中药药理与临床,2007,23(5):206.

[11]张金艳,李贻奎,赵乐,等.冠心Ⅱ号不同组分配伍对体外血栓形成､血小板聚集和镇痛作用的影响[J].中药药理与临床,2010,26(1):1-3.

[17]刘金平,向水,董念国,等.细胞因子信号转导抑制因子3抑制血小板衍生生长因子-BB诱导的血管平滑肌细胞炎症反应的作用及其机制[J].中华实验外科杂志,2012,(4):581-584.

基金资助:国家自然科学基金委员会面上项目(No.82174214,82074418);

文章来源:骆金文,刘敏,于燕乔等.冠心病进展相关基因筛选及冠心Ⅱ号方干预靶点的预测[J].中西医结合心脑血管病杂志,2024,22(03):393-401.