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经口摄入微塑料致小鼠肺部炎性损害及其机制初探

2024-10-09 147 上传者：管理员

摘要：目的研究微塑料(MPs)经口摄入途径对小鼠肺组织的影响，并初步探索其影响机制。方法采用聚苯乙烯微塑料(PS-MPs)模拟环境中MPs。将Balb/c雄性小鼠随机分为3组：对照组(Control)、0.05μm和0.5μm的MPs实验组，设计小鼠发育期和成熟期两个阶段暴露剂量。在发育期分别灌胃0.05μm、0.5μm MPs(0.3 mg/d),连续4周，进入成熟期，将剂量改为0.6 mg/d,再持续8周。对照组灌胃同体积蒸馏水，所有小鼠在16周时被处死。HE染色观察肺组织形态；分析PanglaoDB数据库中小鼠肺组织中表达NLRP3的细胞簇；免疫印迹法测定肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达。结果 HE染色肺组织结果显示，0.05μm和0.5μm MPs组均能诱导小鼠肺组织炎性损害；PanglaoDB数据库中肺组织表达NLRP3的细胞簇为巨噬细胞；免疫印迹法检测肺组织样本结果显示，相比Control组，微塑料组小鼠肺组织蛋白表达均有增加趋势，但仅有0.05μm MPs实验组中蛋白表达有统计学意义(P<0.05)。此外，与0.5μm MPs组相比，0.05μm MPs实验组小鼠肺组织中的蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。结论经口摄入微塑料可能过度激活NLRP3炎症小体引发肺脏炎性损害。同时，针对0.05μm和0.5μm的微塑料，粒径越小对肺的炎性损害越严重。

关键词：
NLRP3炎症小体
PanglaoDB数据库
微塑料
炎性损害
肺
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2023年，联合国环境署《抗塑料污染实践指南》指出：人类每年生产4.3亿吨塑料，其中三分之二是短期产品，造成塑料废弃物快速增加。目前政府和工业界承诺：2040年内让每年流进海洋的塑料总量减少8%,但塑料污染所带来的社会经济成本。此外，人类还在继续生产塑料产品，广泛用于汽车、住房、医疗器械、衣服和洗发水中，抗塑料污染任务依然艰巨。有关媒体报导野生动物因塑料袋窒息的影像固然令人心碎，但许多肉眼看不到的塑料污染对动物或人类造成的伤害可能更严重[1]。环境中的塑料废弃物可降解成粒径小于5 mm或更小的塑料颗粒或碎屑，被称之为微塑料(microplastics, MPs),是一种新型环境污染物[2]。MPs主要通过消化道经口摄入、呼吸道吸入、皮肤接触和医疗应用四个途径进入人体[3],其中消化道经口摄入被认为是人类接触MPs的最主要途径[4],MPs可随着食物链富集和传递，而人类作为食物链的顶端，MPs最终可能威胁人类健康[5]。聚苯乙烯微塑料(polystyrene microplastics, PS-MPs)作为最常见的MPs类型之一，可穿过各种生物屏障，最终沉积于多个器官和组织导致代谢紊乱和损伤，如肺毒性、生殖毒性、肝毒性和神经毒性[6],因此本研究中采用PS-MPs作为模拟MPs的实验材料。目前，针对MPs肺毒性的相关研究大多集中于呼吸道吸入途径，MPs经口摄入途径导致肺毒性的相关研究目前仅见1篇报道[7],其中使用MPs粒径范围为10～50μm,仅做了描述性研究，对肺毒性机制未做深入探讨。这些研究认为，MPs的肺毒性与氧化应激和炎症密切关联，但其确切作用机制仍不清楚，需进一步研究。此外，目前多数研究认为，MPs粒径越小，可能对机体损伤越大。另有研究报道，直径在0.1～1μm MPs可以穿过人体细胞膜[8]。基于此，本研究采用0.05μm和0.5μm更小粒径的MPs,便于观察MPs进入小动物(小鼠)细胞和组织后的毒性效应。

含pyrin结构域NOD样受体家族3(NODlike receptors family, pyrin domain containing 3, NLRP3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteases, Caspase)-1,以及含有Caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck like protein containing CARD, ASC)组装成为胞内蛋白复合体，即NLRP3炎症小体，它是炎症反应的核心，能够识别内源性和外源性炎症刺激，激活Caspase-1后促进白介素(interleukin, IL)-1β、IL-18过度产生，引发机体炎症反应[9]。过度、持续的炎症反应对机体健康极其不利，而NLRP3炎症小体与肺损伤、动脉粥样硬化、痛风等多种炎症性疾病发生发展密切相关[10]。因此，严密调控炎症反应过程中NLRP3炎症小体的活化对炎症性疾病的防治意义重大。另有研究表明，肺损伤机制可能与NLRP3/Caspase-1信号通路有关，胸科手术老年患者在围术期使用右美托咪定，可改善术中氧合及肺动态顺应性，降低炎性因子产生，从而减轻肺部炎症反应[11]。

鉴于以上因素，本研究观察小鼠经口摄入微塑料对小鼠肺脏的影响，结合PanglaoDB数据库分析并检测小鼠肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达，初步探索微塑料对小鼠肺毒性的影响机制，旨在为微塑料健康风险评估和相关公共卫生政策制定提供初步实验依据。

1、材料与方法

1.1动物实验及伦理声明

3周龄Balb/c雄性小鼠(SPF),购自北京华阜康生物科技股份有限公司(SCXK-2019-0001),环境温度(22±2)℃、相对湿度(50±10)%,光照时间(明/暗12 h),小鼠自由获取饮水和食物。适应饲养1周后，将小鼠随机分为3组：对照组(Control)、0.05μm和0.5μm MPs实验组，每组8只小鼠。0.05μm和0.5μm MPs分别购买于Polysciences (美国)和天津倍思乐公司(中国)。为模拟现实世界中微塑料暴露环境，本研究设计小鼠发育期和成熟期两个阶段暴露剂量[12]。实验组小鼠在发育期分别灌胃0.05μm、0.5μm的MPs(0.3 mg/d),连续4周，进入成熟期，然后将剂量改为0.6 mg/d,再持续8周。所有小鼠在16周时被处死，然后收集小鼠肺组织用于后续实验。所有实验操作均按照“动物福利和使用指导原则”(中国)进行，并经遵义医科大学实验动物伦理委员会批准(NO:ZMU21-2203-532)。

1.2方法

1.2.1苏木精和伊红(HE)染色

将收集到的各组小鼠肺组织样本用生理盐水冲洗后，4%多聚甲醛溶液固定48 h。包埋后用切片机以5μm厚度进行切片，脱蜡水化后，把切片放在载玻片上，烤30 min后放置室温，然后用全自动HE染色机进行染色，最后取出切片并封片，显微镜观察并采集代表性图像。

1.2.2分析PanglaoDB数据库中小鼠肺组织中表达NLRP3的细胞簇

搜索PanglaoDB数据库(https: //panglaodb.se/index.html),点击“Samples”,设置筛选条件为：“Filter by species: Mouse; Filter by protocol: all protocol; Sort on: Tissue”,找到小鼠肺组织样本的数据集，可得到根据单细胞测序定位分析后肺组织的细胞簇结果，其中包含样本的基本信息，以及统计数据涉及细胞数量、表达基因数量、每个细胞表达基因的中位数细胞以及细胞簇数。然后点击 “t-SNE-interactive”,待跳出页面后，在页面下方“type a gene symbol”处输入“NLRP3”,可显示表达NLRP3的细胞簇。

1.2.3免疫印迹法(western blot, WB)

参考文献中的方法[13],采用RIPA裂解液(R0010,Solarbio)提取小鼠肺组织总蛋白，每50 mg肺组织加0.5 mL RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制剂PMSF)。匀浆后在4℃条件下15 000 r/min离心15 min,所得上清液即为肺组织总蛋白。BCA法测定蛋白浓度后，调整蛋白浓度一致，加入1×蛋白上样缓冲液，98℃变性10 min。然后配胶(10%)、上样、电泳、转膜、封膜、抗体膜结合反应、曝光显影，即WB测定相关蛋白的表达。以GAPDH蛋白作为内参，分析相关蛋白的表达水平。GAPDH(60004-1-AP,Proteintech),NLRP3(AG-20B-0014-C100, AdipoGen),Caspase-1(AG-20B-0042-C100, AdipoGen)。

1.3统计学分析

实验数据使用软件SPSS 29.0及GraphPad Prism 6.0统计分析及作图，结果以均数±标准差表示，多组之间的比较采用one-way ANOVA分析，多重比较采用SNK法，P< 0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1经口摄入微塑料对小鼠肺组织病理的影响

小鼠肺组织经HE染色后观察，Control组小鼠肺组织和肺泡结构正常，未见明显的炎性细胞浸润。如图1所示：与Control组相比，0.05μm MPs实验组小鼠肺组织结构紊乱，肺间隔出血，肺泡腔内可见较多红细胞，炎性细胞浸润明显(黑色箭头区域),但部分视野仍可见完整肺泡结构。相比Control组，0.5μm MPs实验组小鼠肺组织和肺泡结构仍可辨，但肺泡血管壁肌层排列紊乱，肺泡腔内红细胞增加，肺间质炎性细胞浸润也增多(黑色箭头区域)。此外，相比0.05μm MPs实验组，0.5μm MPs实验组肺组织和肺泡结构更为完整，肺泡腔内红细胞较少，炎性细胞浸润也较少。

图1不同粒径微塑料对小鼠肺组织病理学形态的影响

各组小鼠肺组织HE染色的代表性图片；×200,n=8。

2.2小鼠肺组织中表达NLRP3的细胞簇为巨噬细胞

肺组织由肺上皮细胞、内皮细胞和间皮细胞、肺泡巨噬细胞、成纤维细胞、周皮细胞、肺泡I型细胞和Ⅱ型细胞、中性粒细胞、NK细胞、T和B细胞、以及主要产生细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的nuocyte细胞和上皮特殊类型细胞如Clara等多种细胞组成。分析数据库中不同肺组织样本，结果均表明NLRP3在肺组织中主要表达细胞簇为巨噬细胞(图2)。

图2小鼠肺组织中主要表达NLRP3的细胞簇为巨噬细胞

PanglaoDB数据库中不同编号小鼠肺组织表达NLRP3的细胞簇，A、B、C:[Mm] Lung (SRA611634:SRS2532205)、[Mm] Lung (SRA638923:SRS2797073)、[Mm] Lung (SRA611634:SRS2532206)小鼠肺组织样本。

2.3 MPs对小鼠肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白表达的影响

经口摄入MPs小鼠肺部炎性细胞浸润增多，PanglaoDB数据库中肺组织样本分析结果也表明，表达NLRP3的细胞簇为巨噬细胞。据此，推测微塑料对小鼠肺毒性机制可能与肺部巨噬细胞和NLRP3炎症小体有关。因此，我们进一步采用免疫印迹法测定肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达。如图3所示：相比Control组，0.05μm MPs实验组小鼠肺组织中Caspase-1和NLRP3蛋白表达水平显著增高(P<0.05);而在0.5μm MPs实验组，这些蛋白表达虽有升高趋势，但无统计学差异。此外，与0.5μm MPs实验组相比，0.05μm MPs实验组小鼠肺组织中的Caspase-1及NLRP3的蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。

图3微塑料对小鼠肺组织中Caspase-1和NLRP3的蛋白表达水平的影响

小鼠肺组织中蛋白表达的代表性结果Control组与MPs 0.05μm组比较，P<0.05;#:MPs 0.5μm组与MPs 0.05μm组比较，P<0.05。

3、讨论

微塑料污染已受到全球关注。2024年，Nature报道[14],目前对微塑料的研究还处于起步阶段，科学家们正在努力探索这些微小颗粒如何进入人体，它们在体内的分布情况，以及它们可能引起的健康问题；NEJM也报道[15],在为期34个月的随访中，与未暴露患者相比，暴露微塑料的颈动脉斑块患者发生心肌梗塞、中风或全因死亡的复合风险更高。这些研究对于理解微塑料对人类健康的长远影响至关重要，相关研究还关系到环境保护和公共卫生政策的制定，政府和国际组织需采取措施来减少塑料污染，保护公众健康。

我们的研究结果显示：经口摄入不同粒径(0.05μm和0.5μm)的微塑料会导致小鼠肺组织产生不同程度炎性损害，微塑料粒径与肺部炎性损害严重程度呈负相关性。进一步分析数据库中不同小鼠肺组织样本，发现肺组织中表达NLRP3的细胞簇为巨噬细胞。这提示，微塑料肺毒性可能与肺部巨噬细胞和NLRP3高度关联。

NLRP3是NLRP3炎症小体的重要组分之一，NLRP3炎症小体活化被认为是机体炎症反应的关键环节。据此，我们采用免疫印迹法进一步检测NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、Caspase-1)在肺组织样本中的表达。结果表明，相比Control组，微塑料组小鼠肺组织蛋白表达均有增加趋势，但仅有0.05μm MPs实验组中蛋白表达有统计学意义。此外，与0.5μm MPs组相比，0.05μm MPs实验组小鼠肺组织样本中的蛋白表达水平升高。结合小鼠肺组织HE染色病理结果，这些蛋白表达越高，肺组织结构紊乱更严重，炎性细胞浸润越多。这表明，微塑料可能经由过度激活NLRP3炎症小体引发肺部炎性损害。

有研究证实，微塑料暴露后在体内有不同的分布模式。在胃肠道中，微塑料(<1.08μm)可以穿透肠道上皮并进入循环系统，大于130μm的微塑料可以通过细胞转运易位到人体组织中[4],特别是0.1μm以下的微塑料能够进入细胞膜并穿越肠道屏障到达血流，然后转移到机体其他器官和组织中[6,8]。这表明，粒径越小的微塑料更易进入体内循环，更易转位到机体器官和组织中。我们的研究结果表明，0.05μm比0.5μm粒径的微塑料对肺部组织的破坏和炎性损害程度更甚，与这些研究的结论一致。

综上所述，经口摄入微塑料可能穿过消化系统屏障进入机体循环，沉积于肺脏并过度激活肺部巨噬细胞中NLRP3炎症小体，进而引发肺脏炎性损害，但其详细过程和更多作用机制还需后续工作进一步阐明。这同时也提示我们，防治塑料污染，除了合理控制塑料来源外，及时处理粒径较小的塑料废物更需引起重视。

参考文献:

[3]朱琳,王妹,潘鸿,等.微塑料生殖和胚胎发育毒性的研究进展[J].现代预防医学,2021,48(18):3285-3289;3294.

[11]王磊,白艳辉,丁彦玲,等.右美托咪定对老年患者单肺通气相关肺损伤时NLRP3/Caspase-1通路的影响[J].遵义医科大学学报,2020,43(4):495-499.

[13]覃明,王海燕,田丹,等.CSE基因敲除小鼠的基因型鉴定方法[J].遵义医科大学学报,2021,44(5):669-672.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(NO:82260632);贵州省科技计划项目[NO:黔科合基础-ZK(2024)一般268];遵义医科大学创新创业训练计划项目(NO:ZYDC2022054);

文章来源:张浪浪,董品志,吴荧浓,等.经口摄入微塑料致小鼠肺部炎性损害及其机制初探[J].遵义医科大学学报,2024,47(09):844-849.