以公众的社会活动需求为根据，由人工所建的公共设施，提供公众工作、学习、经济、文化、社交、娱乐、体育、参观、医疗、卫生、休息和旅游的场所称作公共场所，人群复杂多样、流动性大，公共设施或物品重复使用，易造成交叉污染[1]。公共场所环境卫生状况和疾病传播、流行密切相关，微生物是衡量环境卫生状况的重要指标，存在潜在的健康风险。我国非常重视公共场所微生物污染问题，相关部门也加强了公共场所微生物的监测和督查力度。由于公共场所的自身特点，微生物仍是公共场所污染的重要问题。为了保障人们的身体健康，有效预防公共场所发生传染病，需加强对公共场所环境微生物的监测。公共场所的水、空气、物表、灰尘甚至空调系统都可能存在病原微生物，微生物的采集方法依赖于环境介质的特性，对微生物的监测和分析包括传统培养法和非培养法[2]。由于各种方法存在一定的适用性和弊端，需要根据实际应用和需求，选择合理有效的方法，真实反映公共场所微生物污染状况。本文就公共场所的微生物采样及检测分析方法进行综述，为选择合适的方法提供参考，降低公共场所病原微生物的传播风险。

1、公共场所微生物采样方法

合理有效的微生物采样方法是研究公共场所微生物的第一步，国外研究阐述多种微生物采样方法，但尚无国际共识和标准程序[3-4]。目前我国公共场所微生物采样方法主要依据国家标准GB/T18204—2013《公共场所卫生检验方法》，包含对公共场所的空气、水、集中空调系统、公共用品用具等开展微生物检测[5]；灰尘是评估室内微生物污染水平的常用介质[6]。根据不同环境介质特性，微生物采样方法有以下几种。

1.1空气采样

目前采集空气中微生物常用的方法有自然沉降法、固体撞击法、液体冲击法、气旋式采样法和过滤法[7]。

1.1.1自然沉降法

使用琼脂沉降板采样是在重力作用下在一定时间内收集空气中的微生物颗粒，是应用最广泛的采样方法之一[8]。该方法成本低，操作简单，可长时间连续取样，通过每单位面积沉降板的菌落形成测量收集的微生物颗粒。此方法无需机械辅助，主要收集空气中大分子微生物颗粒，对小分子微生物颗粒的收集效率不高[9]。采样过程受周围气流影响，采样空气量的体积不够准确，适用于各种环境微生物和多样性的监测分析。自然沉降法可在同一时间多次采样或长时间暴露采样，用于公共场所环境微生物初步探索，通常作为定性研究工具或与其他定量分析方法相结合。

1.1.2固体撞击法

空气由取样泵提供采样动力，通过颗粒物收集装置将预设体积的空气吸入到固体培养基[10]。该方法捕获微生物的效率高，且能按照其粒径大小进行分级采样。多级Andersen采样器是最具代表性的采样器，但该方法在采集微生物颗粒时存在颗粒撞击仪器壁的情况，导致颗粒脱落、破碎，引起误差[11]。固体撞击法采集粒谱范围宽、采样效率高，可以频繁更换收集介质，提高样本存活率，避免过载；同时适用于微生物本底浓度较低的环境，是最广泛的定量分析微生物方法之一。采集效率依赖于采样时间和气流速度，若气流速度过快，颗粒反弹，则采集效率降低。

1.1.3液体冲击法

采样器使用液体介质，带有微生物粒子的气流通过喷嘴进入含液室，对微生物进行富集捕获。液体介质的缓冲作用能减少收集过程中微生物粒子的损伤，捕集效能较高[12]。但生物气溶胶的存活率可能通过蒸发、再雾化和颗粒粘附到收集室内壁而降低，适用于短时间的微生物采样过程[13]。液体冲击法的采样效率和准确性受多种因素影响，如液体类型、气流速度、颗粒粒径、设备型号等。液体冲击法应用范围广，对后续微生物计数和检测方法要求低，液体基质不损伤微生物，能较长时间保存微生物活性，可不经过培养直接用于分析。与固体撞击法相比，不能按分级粒径采集微生物，但可以检测可培养微生物，也可以检测不可培养微生物，如病毒。

1.1.4气旋式采样法

通过在仪器气旋室中产生气旋，利用离心作用将微生物颗粒从气流中分离出来，并将其沉积在收集物表面上[14]。该方法的采样阻力小、采集流量大，适用于面积较大的采样场所，通过高流速比浓缩样本，但小粒径颗粒物截留效率和气溶胶至收集物表面的迁移率较低[15]。气旋式采样法和液体冲击法对微生物的活性影响小，微生物在液体介质中可长期保存，常用于了解空气中微生物种群的构成。

1.1.5过滤法

利用泵抽取空气，将微生物颗粒截留在过滤器上。常用的过滤器包括混合纤维素酯、聚丙烯、聚偏二氟乙烯、聚氯乙烯和聚碳酸酯等多种过滤膜[16]。该方法简单易用、便携，是一种高收集效率、连续且稳定的微生物采样方法，不依赖于后续微生物培养，适合多种下游微生物分析技术，是一种理想的微生物采集方法。但如果长时间连续采样，过滤器容易饱和，不能保证恒定的采样量，且可导致滤膜干燥，影响微生物的活性[17]。合适的过滤器是采样效率的关键因素，气流速度和采样时间是定量微生物的重要参数。该方法可用于环境低浓度微生物的收集，可做定性或定量分析。

1.1.6静电采样法

静电采样器对空气中微生物颗粒充电、施加电场，使其与气流分离并沉积在带电板上。静电采样器能够有效收集微生物并保持生物活性，该方法依赖于电场电压、仪器尺寸和流速等多种参数。静电采样器可开发自动化操作模式和传感装置的静电微生物采样器，用于实时优化参数，调整采样效率的场合。节约人力，但成本较高，其负面作用及其准确性有待更多的研究论证[18-19]。空气中的微生物采样，根据不同需求可选择不同的方法。选择微生物采样方法时需要考虑几个因素，包括微生物类型、采样环境和采样成本。活性微生物采样需要考虑易清洁和消毒，防止污染环境。不同采样方法的优缺点见表1。

表1空气微生物不同采样方法的对比

1.2水样采集

公共场所用水包括洗浴用水、游泳池水、温泉水、喷泉水、空调冷却水和冷凝水、二次供水等。公共场所用水的微生物采集方法高度成熟，基本采用国家标准方法。若需要监测公共场所用水中的低丰度微生物，或为了捕集更多微生物，小体积水量不满足要求，现场过滤大体积水样是最优选择。通常公共场所用水的微生物检验主要是指洗浴用水、泳池用水、集中空调冷却水和冷凝水中微生物的污染状况，具体采集方法如下。

1.2.1洗浴用水

按照随机抽样原则，兼顾不同类型的洗浴池，在代表性淋浴喷头、浴池、温泉池等采集水样。淋浴喷头：打开淋浴喷头立即采集一定体积的水样，待水温调节成淋浴适宜温度时再次采集等量水样，密封后充分混匀备检。浴池水或温泉水：对正在使用中的浴池水和温泉水采样，在浴池或温泉池中间位置，采集一定体积的水样[20]。洗浴用水的采样体积可适当调整，采集过程应注意样本代表性。

1.2.2泳池用水

游泳池水的微生物采集可参照GB/T18204.6—2013《公共场所卫生检验方法第6部分：卫生监测技术规范》，考虑到游泳池的受众群体，根据游泳池的采样面积确定合适的采样点数，均匀分布采样点，采集水样无菌存储运输至实验室。游泳池水样采集需注重布点合理性，保证样本具有代表性和随机性[21-22]。

1.2.3空调冷却水或冷凝水

空调系统水样包括冷却水和冷凝水，可根据国家标准GB/T18204.5—2013《公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统》方法采样，其中冷却水采样是在冷却塔水库采集，需注意操作过程的无菌原则；冷凝水通常在排水管或者冷凝水盘出口处接水，遵循无菌操作原则采集一定量的水样[22]。公共场所空调系统用水如果添加了含氯消毒剂，则水样需加入硫代硫酸钠溶液用于除去余氯，防止其杀灭微生物，影响检测结果[23-24]。公共场所用水的微生物收集方法主要依赖于场所类型，考虑采样环境，兼顾随机抽样原则，获得公共场所用水的代表性样本。同时需要专业人员、专业操作手法，保证采样工具无菌环境。

1.3物表采样

公共场所物表包括公共设施表面、公共用品用具表面，物表微生物的采样多采用国家标准方法GB/T18204.4—2013《公共场所卫生检验方法第4部分：公共用品用具微生物》。

1.3.1擦拭法

利用生理盐水沾湿的无菌棉拭子，在物体表面来回反复擦拭，根据微生物定量或定性相关要求确定采样面积，通常情况公共场所物表微生物菌种定量分析采样面积为5cm×5cm。如果物表面积不足5cm×5cm，可涂抹整个物体表面；物表形状不规则时，选择与人皮肤接触的表面，涂抹相应面积。对物表微生物进行定性分析，需要获取更多微生物种类信息时，涂抹面积不受约束，可扩大涂抹面积。该方法成本低、操作简单，且采样时不受物表形状与规格的限制，允许在任何情况下收集样本，是公共场所物表采样最常用的方法[25-26]。

1.3.2接触碟法和胶带法

为了满足多元化需求，也可选择接触碟法，取下充满胰酪大豆胨琼脂培养基的接触皿的皿盖，将培养基凸起面按压在台面生物负载样品表面10s，恒定、均匀地施压，按压后将皿拿起，盖好皿盖，进行后续培养计数[27]。该方法可免于受空气污染，接触时间和压力是微生物检测结果的重要影响因素，需根据具体需求设置接触时间和压力参数。胶带取样法：胶带取样法可用于被污染的表面，取样前保持表面平整干燥，将胶带贴在物体表面，然后将胶带取的样本用于固体培养基培养，通常用于半定量分析[28]。

1.4灰尘采样

公共场所灰尘包括地面、墙角、门框、窗台或公共设施表面等长期积压的降尘。根据检测公共环境微生物目的和需求，确定采集的灰尘量，通常是mg~g范围。对于容易采集灰尘或灰尘量大的公共区域表面，使用毛刷将积尘集中收集至无菌袋内，密封低温保存，待后续微生物检测。对于公共场所积尘量少且平滑的公共区域表面，可采用真空吸尘器采样，将吸尘器舱室灰尘集中倒至无菌存储器中，采样时间、采样量、采样面积等根据需求设定。对于公共场所环境面积大、积尘量多、不平整的表面，扫帚是一种不错的灰尘收集工具。采用过程需使用无菌手套等无菌操作装备，保持采样过程样本不受污染，待进一步微生物分析[29-30]。

1.5空调系统采样

公共场所空调系统的微生物采样通常指集中空调系统的送风（空气）、风管（物表）、空调水（冷凝水和冷却水）。针对公共场所集中空调系统，国家标准GB/T18204.5—2013《公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统》规定了集中空调送风中微生物、风管内表面微生物、冷凝水、冷却水微生物的采集方法。送风中微生物采样方法同前文“空气采样方法”中“固体撞击法”相似，按照标准要求，在风口下方15～20cm、水平方向向外50～100cm处，利用撞击式微生物采样器采集预设流量的空气。风管内表面微生物采样方法同前文“物表采样”中“擦拭法”，无菌棉拭子采集50或100cm面积的风管内表面，保存至生理盐水中，待后续微生物检测。冷凝水和冷却水的采集方法同前文水样采集方法描述相同[31]。

2、公共场所微生物检测分析方法

目前对公共场所微生物的检测分析方法主要有培养法和非培养法[2]。传统的培养法在我国公共场所卫生监督中的应用最广泛，但是培养周期长，检测工作量大，只能检测到可培养的微生物，且部分表现特征变异的菌株利用传统的形态学经验方法难以辨别，具有较大局限性。非培养法主要针对微生物的核酸和蛋白质等生物大分子，从结构、遗传信息和代谢信息层面对菌株的种属及来源做出判断，包括传统分子生物学技术、高通量测序技术、光谱、质谱等多种检测技术[2，32]。以PCR及其后续衍生技术为代表的传统分子生物学技术特异性强、灵敏度高，但是无法分辨样品中微生物的存活情况，获得的信息无法揭示活性微生物对健康效应的影响[33-34]。高通量测序技术的通量大、速度快，但是分析计算资源要求高，仪器成本昂贵，不易普及；样本污染容易导致准确度低，结果报告的可读性较差。质谱和光谱技术的快速发展是对传统技术的创新，实现了更简单方便、低成本、快速的微生物鉴定，但需要突破技术的局限性，扩大目标微生物数据库，对未知菌种检测需完备[32]。

2.1分离培养法

目前分离培养法是我国针对公共场所微生物检测应用最广泛的方法，也是国家标准GB/T18204.3—2013《公共场所卫生检验方法》规定的方法[35]。分离培养法通过细菌的菌落特征、生理生化试验结果鉴定细菌种类，以平板上微生物的集落生成单位（colonyformingunit，CFU）进行计数。该方法是实验室鉴定病原体的金标准，操作容易，成本低廉，但培养过程消耗大量时间和人力、物力资源，结果的准确性与实验人员的专业技术水平密切相关[36-37]。自然环境中仅有0.1%～1.0%的微生物可通过培养法鉴定[38-39]，所以此方法仅能检测到环境空气中的部分微生物，有一定局限性。

2.2PCR技术

2.2.1普通PCR

PCR是常见的分子生物学技术，在微生物检测方面的应用较成熟[40]。和传统的分离培养相比，PCR具有特异性强、灵敏度高、操作快捷、迅速省时等优点，目前PCR检测技术多应用于临床重点关注的病原微生物，对罕见微生物检测仍有待开发[41]。此外，微生物在靶标区域发生变异也可导致漏检的发生[42]。

2.2.2荧光定量PCR（quantitativepolymerasechainreaction，q-PCR）

随着PCR技术的进一步开发与应用，在普通PCR的基础上开发了q-PCR技术，在微生物生态学中对不同环境样本的分类学和功能基因标记物的丰度定量方面已得到广泛应用[43]。q-PCR是一种定量技术，可以实时监测整个扩增过程，具有较好的特异性及较高的灵敏度，且无需对产物进行后续处理，可避免对环境造成污染，更准确高效地完成公共场所微生物的检测[44]。巢式PCR、多重PCR、数字PCR等多种PCR技术逐步得到发展，是现代分子生物学技术体系中必不可少的关键步骤，可用于二代测序技术的文库构建、酶联免疫法的前置技术[45]。

2.3高通量测序技术

高通量测序已广泛用于各领域，常被用来分析样本中微生物种群结构和功能预测，包括扩增子测序、宏基因组测序[46]。

2.3.1扩增子测序

扩增子测序的研究对象是微生物编码核糖体亚基rRNA的DNA序列，扩增基因组的特定区域，富集目标DNA片段，对扩增产物进行高通量测序，分析样本微生物种群结构、多样性、系统进化等[47]。16SrRNA测序基于原核生物核糖体亚基16SrRNA标记基因，进行细菌、古细菌的多样性分析[48]；18SrRNA用于测定真核生物，编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列，适用于作为物种分类单元及系统发育的分子标记。在真菌中，相比于18SrRNA，内转录间隔区ITS1和ITS2作为非编码区具有更高的丰富度和分辨率，能提供更详细的种属信息，被广泛用于真菌的鉴定[47]。扩增子测序具有高通量、高准确性、高灵敏度等优势，节省时间和成本，能够鉴定低丰度和不可培养的微生物；缺点是微生物污染时影响测序结果，分辨率一般为属水平，无法有效区分种水平的差异[49-50]。

2.3.2宏基因组测序

宏基因组测序的研究对象是环境微生物样本的总DNA[51]。和扩增子测序相比，其数据总量更大，可以发现更丰富的微生物并获取其群落的遗传、生态等特性，不局限于已知的基因序列，是研究复杂微生物群落特性的重要方法[52]。宏基因测序对于样本量的要求严格，且样本污染影响检测结果。目前常用的高通量测序平台的微生物基因序列数据不全面，缺乏标准的数据分析工具进行统一化处理[53]。宏基因能获得公共场所局部环境全部的微生物信息，包含活细胞和死细胞的DNA序列，还能识别出环境中致病微生物和非致病微生物[54]。宏基因组测序彻底改变了病毒鉴定，能够从不同环境中获得的宏基因组数据中有效检测多瘤病毒、人乳头瘤病毒等活病毒的序列，在病毒检出方面具有显著优势[54-55]。

2.4质谱法

质谱法是一种强大的分析技术，在各个领域都有应用。根据待测物的质荷比来识别和量化分子，以特定的蛋白质或脂质特征区分不同的微生物，如细菌、真菌和病毒，具有快速，低检出限、高灵敏度等优点[56]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）是一种重要的检测微生物方法，能根据微生物的核糖体蛋白特征，参照微生物标准谱图，快速鉴定菌种。该方法简单、成本效益高，不需要高技能人员，在环境灰尘和空气样本中鉴定细菌和真菌方面的应用越来越广泛，已成为微生物菌种鉴定的标准方法[57]。质谱法鉴定微生物种类，可以节约常规方法的试剂，但需突破技术瓶颈，扩大可检测微生物的数据库。

2.5光谱法

光谱技术基于微生物分子组成的光学特性，红外辐射不同微生物可引起不同官能团的激发和振动，形成不同特征光谱峰。典型的傅里叶变换红外光谱已经成功应用于快速微生物鉴定[58]。和传统培养法和分子生物学方法相比，具有实时性和非破坏性的显著优势。拉曼光谱是一种非侵入性光学技术，使用非电离激光激发电子云进行散射，根据分子特征鉴定菌种，是识别病原微生物的重要技术手段[59]。核磁共振光谱是一种广泛用于同位素富集的未知分子或化合物的结构阐明的主导技术，已用于鉴定金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌[60]。光谱在微生物检测领域的应用还需要更多论证。

2.6其他微生物的检测分析方法

2.6.1核酸探针

以碱基配对为原理，以序列已知的核酸片段作为探针鉴定微生物种类，可用于鉴定难以观察、无法培养的微生物产物，用于判断公共场所环境是否有耐药菌株污染或某些特定病毒污染。

2.6.2基因芯片

将大量生物活性分子排列在载体上，同时检测多种靶标。该方法效率高，短时间可判断样本是否有污染，此方法可用于环境中病原微生物的检测，但受限于基因芯片上标记的DNA序列[61]。

3、结语

公共场所微生物污染关系到人们的健康。微生物的采样及检测分析技术在不断地发展，多种技术联用是其发展方向。当前，微生物采样技术已达到高度成熟阶段，能够根据不同环境介质采取针对性的采样策略，包括空气、水、物表、灰尘和空调系统等。微生物的检测分析方法在发展过程中也倾向于多种方法联用，传统培养法因其直观性和可靠性，仍是公共场所微生物活菌检验的重要标准。PCR、扩增子测序、宏基因测序根据DNA序列有效获取公共场所微生物种类信息，是研究公共场所环境微生物群落的有效方法。质谱法和光谱法作为新兴技术，通过和其他技术结合，显著提高了环境微生物检验的效率和准确性。本文综述的技术和方法为有效监测、评估和改善公共场所的卫生环境提供了科学依据和重要支持。

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基金资助:上海市卫生健康委员会青年项目（20234Y0301）;上海市卫生健康委员会面上项目（202240327）；第六轮加强公共卫生体系建设三年行动计划重点学科建设（GWVI-11.1-38）；

文章来源:李晓静,张莉君,吴永康.公共场所环境微生物采样及检测分析方法[J].中国国境卫生检疫杂志,2025,48(02):198-203.