首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 公共卫生论文 > 环境医学论文 > 缺氧微环境对转移性皮肤黑色素瘤预后及免疫治疗的影响

缺氧微环境对转移性皮肤黑色素瘤预后及免疫治疗的影响

2024-08-28 73 上传者：管理员

摘要：目的建立一种基于缺氧基因模型来评估皮肤黑色素瘤（skin cutaneous melanoma, SKCM）预后和免疫微环境。方法自2023年3—7月，河西学院附属张掖人民医院公卫科通过检索公共数据库（TCGA、GEO、GTEx）查找SKCM病例，Cox回归分析筛选缺氧相关性状的基因。构建了一个包含7个缺氧基因的风险模型。GSEA用于比较两组的富集差异，使用CIBERSORT工具研究免疫细胞和基因特征之间潜在的相关性。结果发现SKCM缺氧模型含有的7个基因（FBP1、GPI、BGN、SERPINE1、SDC4、PGM1、EGFR）高风险组患者的存活率低于低风险组。此外，9种免疫细胞在高、低风险组患者的组织中有明显的浸润差异。结论缺氧与SKCM患者的预后和免疫细胞浸润的发生率相关，这为个性化治疗的发展提供了免疫学视角。

关键词：
免疫治疗
公共数据库
生物信息学
皮肤黑色素瘤
缺氧
加入收藏

皮肤黑色素瘤（skin cutaneous melanoma,SKCM）是最具侵袭性的皮肤癌，占皮肤恶性肿瘤死亡人数的80%以上[1]。转移是癌症复发和死亡的主要原因。这一过程涉及内在肿瘤细胞特性之间复杂的相互作用，以及癌细胞与多种微环境之间的相互作用[2]。转移性黑色素瘤具有快速进展和巨大的转移能力[3]，同时转移性皮肤黑色素瘤是一种致死性疾病，存活率较低，大多数治疗方法可产生迅速耐药性[4]。尽管BRAF抑制剂和MEK抑制剂的联合应用可以提高应答率、中位无进展存活率和总存活率，但耐药性仍然不可避免[5]。因此，有必要充分了解转移性黑色素瘤的标志物以揭示新的靶点。缺氧是实体肿瘤的一个特征，决定了放疗、常规化疗或靶向治疗有抵抗力的侵袭性和侵袭性恶性克隆的选择[6]。研究表明，在缺氧条件下，肿瘤中程序性死亡配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1）的表达上调[7]。近年来，越来越多的研究开始关注肿瘤微环境（tumor micro-environment,TME）的分析[8]。此外，缺氧触发IL-1β/IL-1R1信号通路，导致肿瘤细胞的增殖和侵袭性反应，并促进癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAF）的侵袭性特征产生[7]。鉴于肿瘤微环境中缺氧与免疫状态之间的相互依赖性可能影响肿瘤的免疫活性、治疗反应和预后，综合分析缺氧和免疫状态可能具有良好的预后价值，并为SKCM的转化研究和治疗决策提供思路。自2023年3—7月，河西学院附属张掖人民医院公卫科通过基于公共数据集进行综合生物信息学分析，旨在建立并证实联合缺氧和免疫相关基因特征，以预测转移性SKCM患者的预后、风险分层和治疗反应。

1、对象与方法

1.1数据收集与处理转移性SKCM患者的转录组学数据和临床数据均来自癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）、基因表达综合数据库（gene expression omnibus data base,GEO）和基因型组织表达数据库（genotype-tissue expression,GTEx）。下载的文件使用Perl软件和R包进行处理转换并消除不合格数据。对所有数据进行去批次、校准、标准化和log2转换。为了减少统计偏差，排除了OS值缺失的患者数据。将所有TCGA数据库与GTEx数据库的样本作为实验组（812份正常样本和334份癌症样本），GEO数据库的样本（GSE65904）作为验证组（214份癌症样本）。从GSEA网站收集与缺氧相关的基因集。

1.2蛋白质间相互作用网络分析

采用STRING数据库分析蛋白质之间的相互作用并构建蛋白质互作（protein-protein interaction networks,PPI）网络图。Score>0.4的交互作用被认为具有统计学意义。采用R软件选择具有最相邻节点的50个基因进行进一步研究。

1.3缺氧模型的构建与分组

结合TCGA中转移性SKCM的生存信息，筛选出的缺氧相关基因进行了单变量Cox回归分析。将P<0.05作为过滤条件进一步筛选出与预后相关的特征基因。将上述单变量Cox回归分析筛选出的13个具有预后意义的基因进行多变量Cox回归分析，以产生最小的交叉验证误差。基于交叉验证，最终获得了7个具有回归系数（Coef）的基因。通过以下公式计算训练集和验证集中每个患者的风险评分。风险评分=基因1表达量×风险系数+基因2表达量×风险系数+……+基因7表达量×风险系数

1.4预后模型特征与其他临床特征的独立性

将训练集和验证集中的所有患者根据中位风险评分分为高风险组和低风险组。然后使用训练集和验证集高风险和低风险组进行PCA分析。基于上述评分使用R包绘制Kaplan-Meier生存曲线，并构建单变量和多变量Cox比例风险模型进行生存分析。随后构建列线图并预测其对1、3、5年转移性SKCM OS的预测能力。校准图用于说明实际结果与基于Hosmer-Lemeshow试验的模型预测之间的一致性。

1.5基因集富集分析

在缺氧模型的高风险组和低风险组之间富集分析，采用R包“clusterProfiler”进行GO和KEGG分析，对差异表达基因的功能进行注释，以|log FC|>1和P<0.05为功能注释的显著富集。

1.6免疫细胞浸润分析与免疫相关基因分析

采用R“CIBERSOR”包确定每个样品中22个免疫细胞的比例。在R“limma”包中，“gg Extra”包、“ggplot2”包、“ggpubr”包用于探索缺氧风险与基因表达之间的关系，以及在寻找执行关键基因的患者中缺氧高风险和低风险之间不同的表达水平调节免疫细胞中的作用。

1.7统计学处理

采用R 4.1.1统计软件对数据进行统计学分析。两个独立样本与非参数数据之间的比较和多个样本之间的比较分别采用Wilcoxon检验和Kruskal-Wallis检验。参数数据采用t检验和单因素方差分析。分类变量采用χ2检验或Fisher精确检验，采用皮尔逊分析来评估相关性，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1转移性SKCM中缺氧相关基因的鉴定与筛选

首先，从TCGA数据库中提取了转移性SKCM的52867个基因表达，并从GSEA筛选出200个缺氧相关基因。与TCGA、GTEx和GEO数据集中包含的总基因相交后得到197个缺氧相关基因。随后采用STRING对缺氧相关基因中的PPI进行建模（图1a,b）。网络中每个蛋白质的节点数用于识别中心基因。图中显示了前50个必需基因。采用单变量Cox回归分析和多变量Cox分析筛选预后相关基因。通过单变量Cox回归分析，结果显示，ALDOA等13个基因与SKCM的预后相关（图1c）。多元Cox回归分析确定了7个与患者预后相关的独立基因（图1d）。并选择这7个基因来构建预后风险模型，使用中位风险评分将患者分为高风险和低风险类型。

2.2通过主成分分析及生存分析进一步验证缺氧相关基因模型的分组能力

采用训练集和验证集两个数据集分别对高风险组和低风险组进行PCA（图2a,b）。构建的风险模型的分析结果表明，低风险组和高风险组具有不同的分布。这表明风险模型可以区分低风险组和高风险组。训练集生存分析的K-M曲线显示，低风险组的OS显著优于高风险组（P<0.05；图2c）。此外，对模型基因进行的验证分析，产生了相似的结果（图2d）。两个数据集的风险柱状图也显示，高风险组中的死亡例数高于低风险组。

图1缺氧相关基因的筛选及其与患者预后的关系

图2风险模型分组能力的验证

2.3转移性SKCM患者缺氧相关基因列线图模型的构建和验证

临床特征和风险评分的单变量和多变量Cox回归分析，用于评估7个缺氧相关基因是否具有转独立预后特征。单变量Cox回归分析显示，风险评分的风险比和95%CI分别为2.049和（1.085,2.492)(P<0.001）。列线图的危险比和95%CI分别为1.591和（1.450,1.745)(P<0.001）。多变量Cox回归分析显示，风险评分的风险比和95%CI分别为2.097和（1.697,2.591)(P<0.001）；列线图的风险比和95%CI分别为1.511和（1.337,1.708)(P<0.001）。这表明7种缺氧相关基因的是转移性SKCM独立的预后因素。构建列线图模型能够更好的预测SKCM患者的预后。1、3、5年的校准曲线表明，构建的风险模型可以更好地预测预后（图3a）。为了更好地评估列线图在预测转移性SKCM患者预后中的特异性和敏感性，评估列线图ROC曲线下面积（图3b）列线图的AUC也高于年龄、性别、分期和风险评分，表明7个缺氧相关基因模型在转移性SKCM的预后风险模型中更可靠。

2.4高低风险组差异基因的KEGG富集分析与GO功能分析

采用“limma”R包对高低风险组基因进行差异分析，然后采用“clusterProfiler”R包进行GO富集分析，结果显示为气泡图。气泡的大小代表GO中的基因数量，气泡的颜色代表GO中调整后的P值，GO富集分析研究靶基因的潜在生物过程（biological process,BP）、细胞成分（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）。在P<0.05的条件下，获得显著富集的GO术语的前10个术语。GO分析结果表明，这些靶基因在BP的免疫反应激活、抗原受体-介导信号通路、免疫反应-激活细胞表面受体信号通路、免疫反应-0激活信号转导等中显著富集；在CC的质膜外侧、免疫球蛋白复合物、质膜信号受体复合物、T细胞受体复合物等均有参与；在MF的抗原结合、免疫球蛋白受体结合、细胞因子受体活性、细胞因子结合等中发挥重要作用。KEGG富集分析的圈图显示，差异基因在造血细胞系、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Th1和Th2细胞分化、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、胰腺分泌物和Th17细胞分化通路中显著富集（图4）。

2.5高低风险组间的免疫浸润分析

从Tracking Tumor Immunophenotype数据库下载肿瘤相关的免疫基因，分析实验组和验证组两个数据集中与肿瘤负相关的免疫基因在高低风险组中的差异调控。选择免疫检查点PD-1进行研究，发现其与SKCM成负相关（图5a），且在高低风险组中也具有差异表达（图5b）。同时还选择CD8细胞的相关基因分析，其在实验组和训练组中高低风险组的差异调控（图5c,d）。

3、讨论

缺氧是肿瘤生理学的一个特征，特别是与获得某些恶性特征相关的机制，如转移、侵袭和耐药性[9]。在这些过程中，缺氧相关基因作用于相应的通路或调节免疫细胞[10]。大多数实体肿瘤都存在一定程度的缺氧，因为异常血管的供氧不足，无法满足快速增殖的癌细胞的需求[11]。血管提供氧气和营养，清除细胞代谢的副产物，是免疫细胞和传播癌细胞的主要运输途径之一[12]。本研究筛选了SKCM的缺氧相关基因，发现7个核心基因（FBP1、GPI、BGN、SER-PINE1、SDC4、PGM1、EGFR）与患者预后及免疫密切相关。随着对缺氧机制的深入了解，其对肿瘤预后的影响也越来越被了解。为了进一步研究缺氧相关基因的表达与患者预后之间的关系，本研究通过对TCGA和GEO数据库的探索与研究，发现FBP1、GPI、BGN、SERPINE1、SDC4、PGM1和EGFR的表达水平与缺氧微环境、炎症和免疫反应之间存在密切关系。在本研究筛选的核心基因中，FBP1通过参与卵巢癌中的C-MYC/STAT3信号轴调节增殖、转移和化疗耐药，在胰腺癌中显著下调，通过调控MAPK信号通路参与前列腺癌细胞上皮间质转化、侵袭和转移等[13-15];GPI在乳腺癌细胞的细胞表面GPI锚定蛋白水平显著升高，且GPI-T催化活性的上调是肿瘤发生或侵袭的机制[16];BGN与TME中的免疫和基质评分呈正相关，主要参与免疫反应的调节，在免疫抑制表型中强烈表达，并与结肠癌中多种免疫细胞的浸润密切相关，尤其是M2型巨噬细胞，在胃癌中较高水平的BGN与胃癌中较短的OS时间具有显著相关性[17-19];SERPINE1的过表达可影响口腔鳞状细胞癌细胞增殖、活力和凋亡[20];SDC4作为一种主要的内源性膜相关受体，在人类肿瘤发生和发展中广泛调节细胞骨架、细胞黏附和细胞迁移[21],SDC4基因沉默可抑制EMT，并通过抑制人甲状腺乳头状癌Wnt/β-catenin信号通路的激活来增强细胞凋亡[22];PGM1通过调节PI3K/AKT通路抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭[23]。EGFR已被确定为非小细胞肺癌的致癌驱动因素，尤其是激活突变EGFR及其与特定TKI的抑制可产生显著的肿瘤反应[24]。EGFR负责癌症干细胞（cancer stem cells,CSC）的维持和功能，包括干细胞代谢、免疫调节活性、休眠和治疗抗性[25]。综上所述，本研究建立的缺氧相关基因的预后模型所筛选的7个核心基因均与肿瘤的发生发展及肿瘤微环境等相关。然而，研究存在一些局限性。本研究证据基于生物信息学方法，应在通过更多的实验室实验和临床试验进行验证之前进行初步考虑。

图3风险模型与临床特征之间的关系

图4 KEGG富集分析圈图

图5调节免疫细胞行为的基因与缺氧风险之间的关系

总之，缺氧在肿瘤微环境中起着重要作用。筛选可能影响免疫细胞浸润率的基因显示，这些基因与缺氧风险评分之间存在相关性。研究表明，缺氧相关基因可以影响转移性SKCM的预后，并可能在转移性SKCM的免疫浸润中发挥作用。分析缺氧与免疫细胞之间的关系可能会改进免疫治疗和肿瘤治疗。

文章来源:杨文超,秦瑞宁,张俊瑕.缺氧微环境对转移性皮肤黑色素瘤预后及免疫治疗的影响[J].中国美容整形外科杂志,2024,35(08):471-476.