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不同成瘾程度吸毒人员毛发样本采用气相色谱-质谱联用法检测的结果分析

2020-08-27 340 上传者：管理员

摘要：目的建立可同时快速测定人毛发样品中苯丙胺、甲基苯丙胺、3,4-亚甲基二氧基苯丙胺和3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺的方法。方法以NaOH溶液水解毛发,经三氟乙酸酐酰化处理,进样气相色谱-质谱联用系统(GC-MS)分析,色谱柱:HP-5 MS(30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm),流动相:氦气,流速:1.00 mL·min-1,柱温:80℃维持2 min,以30℃·min-1增加到180℃,再以10℃·min-1增加到210℃,再以30℃·min-1增加到280℃,维持10 min,进样阀、离子源和四级杆温度分别为280℃,230℃和200℃,进样量:1μL,电子轰击电离,用单反应监测模式,定量分析离子分别为m/z 118 (苯丙胺)、m/z 154 (甲基苯丙胺)、m/z 162 (3,4-亚甲基二氧基苯丙胺)、m/z 162 (3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺)、m/z 176(4-苯基丁氨)。结果苯丙胺标准曲线方程为y=3.36e+000x+6.08e-002(r=0.999),线性范围为1.5～150 ng·mg-1;甲基苯丙胺标准曲线方程为y=3.38e+000x+9.35e-002(r=0.999),线性范围为1.5～150 ng·mg-1;3,4-亚甲基二氧基苯丙胺标准曲线方程为y=2.49e+000x+2.44e-002(r=0.998),线性范围为1.5～150 ng·mg-1;3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺标准曲线方程为y=2.90e+000x+6.38e-002(r=0.999),线性范围为1.5～150 ng·mg-1。批内、批间精密度均在1.97%～9.18%,准确度在94.28%～107.78%,提取回收率均大于85.00%,稳定性好。结论本方法样本处理简便,灵敏度高,专属性强,适用于上述四种化合物的毛发样本浓度测定。

关键词：
成瘾
毛发
气相色谱-质谱联用
灵敏度
甲基苯丙胺
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苯丙胺类化合物是流行最广泛的毒品之一,危害巨大[1,2]。气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)是该类化合物检测的标准技术方法[3,4],目前毛发量用量少,灵敏度高GC-MS方法仍待开发。本研究拟建立用于人毛发中苯丙胺类化合物测定的GC-MS方法,探索不同成瘾程度吸毒人员毛发样本中药物含量是否存在显著差异。

材料、对象与方法

1、药品与仪器

药品及试剂苯丙胺(amphetamine,AMP),纯度:99.80%,批号:FE072712-02,购自美国Cerilliant公司;甲基苯丙胺(methamphetamine,MA),纯度:99.90%,批号:FE061710-02,购自美国Cerilliant公司;3,4-亚甲基二氧基苯丙胺(3,4-methylenedioxyamphetamine,MDA),纯度:99.70%,批号: FE042910-01,购自美国Cerilliant公司;3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(3,4-methylenedioxymethamphetamine,MDMA),纯度:99.50%,批号:FE012111-07,购自美国Cerilliant公司;内标化合物:4-苯基丁氨(4-phenylbutylamine,4-BP),纯度:98.00%,批号:ZXNDK-RR,购自东京化学工业有限责任公司;三氟乙酸酐(trifluoroacetic anhydride,TFA),纯度:99.00%,批号:#BCBJ6391V,购自美国Sigma-Aldrich公司。

仪器6890N气相色谱仪,5973质谱检测器,均为美国Agilent HP公司产品。

2、受试者选择

纳入218例(成瘾人员195例,偶吸人员23例)吸毒人员,年龄≥18岁,无重大基础疾病,无传染性疾病,并自愿签署知情同意书,纳入健康志愿者6例。

3、治疗方法与毛发样品采集

本研究无治疗措施。贴皮采集吸毒人员后枕部毛发30～50 mg,长度4～8 cm。贴皮采集健康志愿者后枕部毛发约1000 mg,长度3～10 cm。

4、测定方法与毛发样品处理

4.1色谱条件

色谱柱:HP-5 MS(30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm),流动相:氦气,流速:1.00 mL·min-1,柱温梯度:80℃ 维持2 min,以30℃·min-1增加到180℃,再以10℃·min-1增加到210℃,再以30℃·min-1增加到280℃,维持10 min,进样量:1.00μL。

4.2质谱条件

电子轰击电离(electron impact,EI),正离子扫描,进样阀温度:280℃,离子源温度:230℃,四级杆温度:200℃。单反应监测模式,定量分析离子分别为: m/z 118(AMP)、m/z 154(MA)、m/z 162(MDA)、m/z 162(MDMA)、m/z 176(4-BP),电子轰击能量均为70 eV。

4.3对照品工作液制备

分别移取AMP、MA、MDA及MDMA标准溶液适量,以甲醇为溶剂,配制成各化合物浓度均为100μg·mL-1储备液,用甲醇梯度稀释得标准曲线工作液,质量浓度如下,AMP、MA、MDA及MDMA均分别为1,5,10,25,75,100μg·mL-1。AMP、MA、MDA及MDMA质控工作液浓度均分别为2,50,90μg·mL-1。

4.4内标工作液

移取内标对照品,以甲醇为溶剂,得内标工作液,质量浓度为50μg·mL-1。

4.5含药毛发样品制备

取工作液15μL至2 mL EP管中,加入空白毛发10 mg,得含药毛发。分析物在含药标准曲线空白毛发中的浓度如下,AMP、MA、MDA及MDMA均分别为1.5,7.5,15,37.5,112.5,150 ng·mL-1。定量下限和低、中、高质量浓度毛发质控样品中分析物的浓度如下,AMP、MA、MDA及MDMA均分别为1.5,3,75,135 ng·mg-1。

4.6毛发样品处理

精密称取毛发样品10 mg于2 mL EP中,加入内标工作液15μL,再加入1 mol·L-1 NaOH溶液1 mL,水解15 min,水浴100℃,离心5 min,转速1.2×104 r·min-1,加入乙酸乙酯750μL,萃取2遍,离心10 min,转速1.2×104 r·min-1,浓缩上清液,加入乙酸乙酯30μL和TFA 25μL,水浴60℃,反应30 min,浓缩,加入甲醇50μL,吸取上清至进样瓶。

5、方法学评价

专属性分别取6份不同来源健康志愿者空白毛发10 mg,不加内标,按照“毛发样品处理”项操作,进行分析。另取空白毛发1份和吸毒人员未知样品1份,空白毛发加入分析物和内标,同法处理。

标准曲线与定量下限含药标准曲线毛发按照“含药毛发样品制备”项制备得到,按照“毛发样品处理”项操作,进样分析。以分析物浓度与内标浓度比为横坐标(x),分析物峰面积与内标峰面积比为纵坐标(y),用加权(w=1/x2)最小二乘法拟合曲线。

精密度与回收率取空白毛发18份,分别配制低、中、高质量浓度质控样品各6份,按照“毛发样品处理”项操作,连续测定3批,以随行标准曲线计算精密度和准确度。分别配制低、中、高质量浓度的质控样品各12份,其中6份于提取前加入工作液和内标,另6份于提取后加入工作液和内标,另制备随行标准曲线样品,进样分析,计算提取回收率。

稳定性制备低、中、高质量浓度毛发质控样品,考察自动进样器放置72 h后稳定性。

结果

1、方法学评价

专属性AMP、MA、MDA、MDMA及4-BP保留时间分别为4.23,4.95,6.48,7.48和5.74 min,毛发内源性物质对待测目标分析物及其对应内标的测定无干扰,专属性好,见图1。

图1毛发样品中的分析物典型色谱图

标准曲线与定量下限AMP的标准曲线方程为y=3.36e+000x+6.08e-002(r=0.999),定量下限为1.5ng·mg-1,线性范围为1.5～150 ng·mg-1;MA的标准曲线方程为y=3.38e+000x+9.35e-002(r=0.999),定量下限为1.50 ng·mg-1,线性范围为1.5～150 ng·mg-1;MDA的标准曲线方程为y=2.49e+000x+2.44e-002(r=0.998),定量下限为1.5 ng·mg-1,线性范围为1.5～150 ng·mg-1;MDMA的标准曲线方程y=2.90e+000x+6.38e-002(r=0.999),定量下限为1.5 ng·mg-1,线性范围为1.5～150 ng·mg-1。

精密度与回收率4种待测化合物低、中、高质控浓度批内、批间精密度在1.97%～9.18%,准确度在94.28%～107.78%。在低、中、高质控浓度下,AMP的平均提取回收率为91.00%～97.27%,MA的平均提取回收率为91.85%～94.18%,MDA的平均提取回收率为88.36%～97.48%,MDMA的平均提取回收率为87.64%～98.62%,见表1。

稳定性含药毛发质控样品于自动进样器72 h稳定,RSD均小于14.00%。

2、方法学应用

使用本方法测定毛发样本218例,其中成瘾人员为195例,偶吸人员为23例。仅有AMP和MA被检出。通过t-检验发现成瘾人员毛发样品MA浓度显著高于偶吸人员(P=0.01)。通过Mann-Whitney检验发现AMP / MA比值在组间无显著差异,与既往报道[1]结论不一致,可能与本研究样本量较小有关。

表1毛发中苯丙胺(AMP),甲基苯丙胺(MA),3,4-亚甲基二氧基苯丙胺(MDA),3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)的精密度与回收率

讨论

苯丙胺类毒品由于其易制备、易成瘾,流行日益广泛,已对社会造成巨大危害。在日常执法中,判断成瘾和偶吸是禁毒执法的重要考量[5,6]。GC-MS法是测定毛发样品苯丙胺类含量的标准技术方法,利用该方法探索更多可用于成瘾程度判断的量化指标,将为禁毒执法提供更加科学的依据。

倪四阳,武峰,王淑民,宋思玥,赵秀丽,周延明.气相色谱-质谱联用法检测不同成瘾程度吸毒人员毛发样本研究[J].中国临床药理学杂志,2020,36(16):2497-2500.

基金:国家科技支撑计划基金资助项目(2011BAK04B08)