结直肠癌(CRC)是世界范围内常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率已升至所有恶性肿瘤第三位，每年新增220万例，死亡110万例[1]。根治性手术及术后辅助放化疗是CRC的主要治疗手段，但肿瘤仍可发生复发及转移[2]。CRC的发病病因和机制尚不清楚，研究CRC预后相关肿瘤标志物，有利于CRC的临床诊治。长链非编码RNA(lncRNA)结肠癌相关转录物2(CCAT2)基因位于8q24,能够作为分子诱饵诱导转录复合物结合调控下游靶基因表达，参与感染、免疫及肿瘤等过程[3]。有研究表明，胃癌中lncRNA CCAT2表达上调，其能与上皮剪接调节蛋白1结合促进CD44 mRNA的选择性剪接，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[4]。N-myc下游调节基因(NDRG)1定位于8q24.22,编码蛋白含有394个氨基酸，参与滋养细胞形成、肥大细胞和巨噬细胞的分化成熟过程[5]。有研究表明，NDRG1在胃癌、卵巢癌等肿瘤中表达下调，其能抑制Wnt信号通路，抑制肿瘤细胞迁移和血管生成等过程，是新的肿瘤抑制因子[6]。还有研究表明，lncRNA CCAT2的表达能够抑制NDRG1基因启动子的转录活性，下调NDRG1的表达，进而促进肝癌肿瘤细胞的增殖和转移[7]。目前，关于lncRNA CCAT2及NDRG1在CRC组织中的表达及临床意义的研究较少，因此，本研究通过检测CRC患者组织中lncRNA CCAT2及NDRG1 mRNA和蛋白表达，分析二者的临床意义。

1、资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年2月至2020年2月在南通市中医院行CRC根治性手术治疗的96例CRC患者作为研究对象。纳入标准：(1)经病理组织检查明确诊断为CRC且接受R0切除及术后以卡培他滨为基础的辅助化疗；(2)原发、初治患者；(3)各项临床资料完整；(4)患者精神状态正常，能够配合治疗和随访；(5)一般身体状况良好，生存质量卡氏评分>80分。排除标准：(1)伴有严重的肾功能不全、肝衰竭；(2)既往有其他恶性肿瘤；(3)围术期死亡；(4)年龄<18岁或>80岁；(5)妊娠期、哺乳期女性。96例CRC患者中，男55例，女41例；年龄30～79岁，平均(62.53±8.15)岁；病理类型：腺癌72例，黏液腺癌及其他24例；肿瘤位置：结肠50例，直肠46例；肿瘤分化程度：中高分化57例，低分化39例；淋巴结转移：无淋巴结转移60例，有淋巴结转移36例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期60例，Ⅲ期36例。所有入选患者均已签署知情同意书。本研究通过南通市中医院医学伦理委员会审批。

1.2 方法

1.2.1 lncRNA CCAT2、NDRG1 mRNA表达检测

留取患者癌组织和癌旁组织(距癌组织边缘>2 cm, 经病理检查明确为正常组织),在加入RIPA裂解液(4 ℃预冷)的研钵中研磨后，3 000 r/min离心10 min, 留取上清液，采用Trizol提取上清液中总RNA,逆转录后进行实时荧光定量PCR反应。实时荧光定量PCR仪器购自美国ABI公司，型号ABI7500。实时荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司，货号RR420A。采用Primer3.0软件设计引物并由上海生工公司合成。引物序列：lncRNA CCAT2上游引物为5′-GCTTAAGTCCAGCCCGAAGT-3′,下游引物为5′-TTCTCTTCAGTGCCCCACTG-3′;NDRG1上游引物为5′-AGCGAAGTGCCAACACCTAAG-3′,下游引物为5′-TGGTGGTTTTCCGGGTCTTG-3′;GAPDH上游引物为5′-TTCGTGGATTCCTGAAAACATCA-3′,下游引物为5′-CCAGCATCAGACAGTTTGGAAC-3′。PCR反应过程：94 ℃ 5 min, 94 ℃ 40 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 50 s, 共循环35次，最后72 ℃ 10 min。反应体系：2×Master Premix 5 μL,引物1 μL(上、下游引物各0.5 μL),互补DNA(cDNA) 0.5 μL和不含核酸酶的焦碳酸二乙酯(DEPC)水3.5 μL。采用2-ΔΔCt法计算各组织中lncRNA CCAT2、NDRG1 mRNA的相对表达水平，每个标本进行独立重复3次实验，结果取平均值。分别以lncRNA CCAT2、NDRG1 mRNA的平均值作为临界值，分为lncRNA CCAT2高表达组(>3.17,46例)和低表达组(≤3.17,50例),NDRG1 mRNA高表达组(>0.85,47例)和低表达组(≤0.85,49例)。

1.2.2 NDRG1蛋白水平检测

将癌和癌旁组织用固定液固定16 h, 石蜡包埋切片，厚度4 μm。组织脱水机和切片机购自德国徕卡公司，型号为ASP3005、RM2235。采用免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥公司，货号：PV9004)进行NDRG1蛋白免疫组化染色。60 ℃烤片2 h, 二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡2次，每次10 min, 100%、95%、80%、70%、50%梯度乙醇水化，每次5 min, 柠檬酸盐抗原修复液中微波炉法100 ℃ 10 min, 自然冷却至室温后，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶室温避光孵育15 min, NDRG1兔多克隆抗体(abcam公司，货号：ab214689)4 ℃孵育16 h, 酶标羊抗兔二抗37 ℃ 30 min, DAB显色5 min, 苏木素染细胞核10 s, 水中返蓝，50%、70%、80%、95%、100%梯度乙醇脱水，每次5 min, 二甲苯透明5 min后，树脂封片，镜下观察染色情况(日本奥林巴斯公司，型号：XDS-1A)。染色以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，以既往证实NDRG1阳性的组织切片为阳性对照。染色结果由2位有经验的病理科医生独立阅片，对于有异议的结果，协商讨论决定。染色程度分评分：未染色0分，淡黄色1分，棕褐色2分。阳性面积评分：<10% 0分，10%～<25% 1分，25%～50% 2分，>50% 3分。将免疫组化染色强度和阳性面积相乘，以结果<2分为阴性，≥2分为阳性。

1.2.3 随访

CRC患者自确诊日起开始定期门诊和电话结合的形式随访，随访终止日期为2023年3月。随访内容包括常规体检、腹盆腔超声及CT等检查，同时了解随访期内CRC患者肿瘤复发、转移情况及生存情况，记录死亡时间和死因。随访终点为随访时间终止或患者发生肿瘤相关死亡。

1.3 统计学处理

采用SPSS27.0软件分析数据，GraphPad Prism8.0绘制统计图。呈正态分布的计量资料以

表示，组间用t检验；计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson相关分析lncRNA CCAT2与NDRG1mRNA的关系，通过Kaplan-Meier生存曲线分析不同lncRNA CCAT2、NDRG1mRNA表达患者的生存差异，采用多因素Cox回归分析CRC患者预后的影响因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 CRC组织中lncRNA CCAT2、NDRG1 mRNA表达

相比于癌旁组织，CRC癌组织中lncRNA CCAT2表达较高(3.17±0.52 vs. 0.85±0.33),NDRG1mRNA表达较低(1.08±0.32 vs. 2.79±0.34),差异有统计学意义(t=36.909,35.884,均P<0.001)。相关性分析显示，CRC组织中lncRNA CCAT2与NDRG1mRNA表达呈负相关(r=-0.647,P<0.001)。

2.2 CRC组织中NDRG1蛋白表达

癌组织中NDRG1蛋白位于细胞质和细胞膜。癌组织中NDRG1蛋白阳性率低于癌旁组织[6.25%(6/96)vs. 90.63%(87/96)],差异有统计学意义(χ2=136.821,P<0.001)。见图1。

2.3 不同临床病理特征CRC患者lncRNA CCAT2、NDRG1 mRNA表达

与TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移比较，TNM分期Ⅲ期、有淋巴结转移的CRC患者癌组织中lncRNA CCAT2表达较高，NDRG1mRNA表达较低，差异均有统计学意义(P<0.001)。见表1。

表1lncRNA CCAT2、NDRG1mRNA表达与CRC患者临床病理特征的关系

图1癌组织和癌旁组织中NDRG1蛋白表达(免疫组化,×200)

2.4 生存预后的关系

患者随访过程中，死亡38例，无失访病例，3年累积生存率为60.42%(58/96)。lncRNA CCAT2高、低表达组CRC患者3年累积生存率分别为47.83%(22/46)、72.00%(36/50)。NDRG1mRNA高、低表达组3年累积生存率分别为78.72%(37/47)、42.86%(21/49)。lncRNA CCAT2高表达组3年累积生存率低于lncRNA CCAT2低表达组(Log-rankχ2=6.958,P=0.008),NDRG1mRNA高表达组3年累积生存率高于NDRG1mRNA低表达组(Log-rankχ2=13.120,P<0.001)。见图2。

2.5 CRC患者预后影响因素分析

以预后为因变量(1=死亡，0=生存，t=时间),以TNM分期，淋巴结转移，lncRNA CCAT2、NDRG1mRNA为自变量，采用多因素Cox回归分析预后影响因素，结果显示TNM分期、淋巴结转移、lncRNA CCAT2、NDRG1mRNA是CRC患者预后的独立影响因素。见表2。

图2Kaplan-Meier曲线分析表达与CRC患者预后的关系

表2预后影响因素

3、讨论

我国CRC每年发病约37.6万例，死亡约19.1万例，并且发病率和病死率有升高的趋势[8]。目前CRC患者生存预后的评估主要依据TNM分期系统，但该系统未纳入肿瘤分化程度、脉管浸润及基因突变情况等，单纯依据TNM分期系统难以准确对CRC患者的治疗情况进行全面判断[9]。因此，寻找用于预测CRC疾病进展及预后的肿瘤标志物，对准确地评估CRC患者的治疗效果，以及指导临床诊治十分重要。

lncRNA是长度介于100～300个核苷酸的RNA分子，能够通过DNA表观遗传修饰、转录修饰等介导基因激活或沉默，广泛参与心血管疾病、神经系统疾病及肿瘤等疾病过程[10]。lncRNA CCAT2是近年来发现的具有致癌作用的lncRNA,有研究表明，lncRNA CCAT2基因rs1281615位点的多态性能够增加乳腺癌的发生风险，是新的评估患者预后的肿瘤标志物[11]。本研究结果显示，CRC组织中lncRNA CCAT2表达较高，这与既往学者研究报道结果一致[12]。有研究表明，结肠癌中lncRNA CCAT2基因rs6983267位点的单核苷酸多态性能够促进lncRNA CCAT2的过度表达，导致染色体基因组不稳定性增加，癌基因N-myc表达升高，促进CRC的肿瘤发生及癌细胞的恶性增殖和转移[12]。笔者认为，本研究CRC组织中lncRNA CCAT2表达升高与单核苷酸多态性有关。本研究还发现，CRC组织中lncRNA CCAT2的表达与TNM分期、淋巴结转移有关，提示lncRNA CCAT2参与促进CRC的恶性进展。原因可能是，lncRNA CCAT2能够通过激活CRC组织中增殖相关信号通路及血管生成信号通路，促进CRC的增殖、侵袭和淋巴结转移。有研究表明，lncRNA CCAT2能通过与肿瘤源性黏附分子15相互作用，促进RAS癌基因家族成员14及下游蛋白激酶B(AKT)/糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)信号通路的激活，导致CRC癌细胞的过度增殖、迁移和侵袭[13]。此外，lncRNA CCAT2还能够作为分子支架结合微小RNA(miR)-200b,上调血管内皮生长因子的转录及蛋白表达，血管内皮生长因子促进血管和淋巴管生成，导致肿瘤血行转移或淋巴转移的发生[14]。本研究中，lncRNA CCAT2高表达的CRC患者生存预后较差，分析其原因，一方面，lncRNA CCAT2的表达升高参与促进CRC肿瘤的增殖及转移，增加术中肿瘤微小肿瘤病灶残留的风险及术后肿瘤复发转移风险[4];另一方面，lncRNA CCAT2的表达能降低放化疗等治疗的敏感性，导致患者不良生存预后。既往研究发现，lncRNA CCAT2通过负调控miR-145/P70核糖体蛋白S6激酶1,抑制宫颈癌细胞中AKT的磷酸化激活，促进肿瘤细胞的放疗抵抗[15]。另外，lncRNA CCAT2还能通过激活人类哺乳动物雷帕霉素靶蛋白途径，降低乳腺癌肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的化疗治疗的敏感性，降低患者新辅助化疗疗效[16]。

NDRG1属于NDRG家族成员，其表达受N-myc的调控，具有抑制细胞增殖和自噬，促进细胞凋亡和分化的生物学作用。近年来有研究发现，NDRG1作为转移抑制因子，其磷酸化激活后能够促进磷酸酶张力蛋白基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖[17]。本研究发现，CRC组织中NDRG1mRNA及蛋白表达均明显降低，与既往学者在CRC肿瘤细胞中报道结果一致[18]。CRC患者组织中NDRG1的表达下调与转录水平异常降低有关。既往研究表明，CRC组织中紧密连接蛋白2能够促进NDRG1启动子处的ZO1转录复合体的解离，抑制NDRG1的转录，导致下游上皮间质转化通路和细胞周期依赖蛋白激酶过度激活，促进CRC肿瘤细胞增殖及转移[18]。本研究中，NDRG1的表达与TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、淋巴结转移有关，表明NDRG1的表达下调促进CRC的肿瘤进展。分析其机制，NDRG1的表达缺失破坏了Rho蛋白二磷酸鸟苷解离抑制因子α和细胞分裂周期蛋白42之间的结合，激活丝切蛋白的表达，促进细胞骨架的重组及丝足的形成，导致肿瘤细胞侵袭性增强[19]。另外，敲除或抑制胃癌肿瘤细胞中NDRG1的表达能够引起基质金属蛋白酶9的表达增加，进而导致细胞外基质降解，促进肿瘤的侵袭和转移[20]。

本研究中，NDRG1低表达的CRC患者预后较差，原因可能是NDRG1的表达降低CRC患者术后辅助治疗的疗效，增加术后肿瘤进展的风险。既往研究表明，NDRG1能够抑制CRC组织中表皮生长因子受体，阻断表皮生长因子受体下游细胞信号传导，增强CRC肿瘤细胞对靶向药物治疗的耐药性，导致患者不良预后[21]。本研究中，CRC组织中lncRNA CCAT2与NDRG1mRNA表达呈负相关，提示二者在CRC疾病进展中可能存在潜在的调控关系。笔者分析，NDRG1基因启动子区域受上游多种lncRNA的表达调节，如lncRNA CCAT2能够直接抑制NDRG1启动子的转录活性，发挥促进肝癌细胞增殖和转移的效应[21]。但CRC组织中lncRNA CCAT2与NDRG1的相互作用机制尚不清楚，有待今后进行深入研究。

综上所述，CRC患者癌组织中lncRNA CCAT2表达升高，NDRG1表达降低，其水平与CRC患者TNM分期、淋巴结转移有关，二者均是影响CRC患者不良生存预后的独立因素。因此，临床上可根据CRC组织中lncRNA CCAT2、NDRG1的表达，对不同预后的CRC患者进行风险分层，并采取相应治疗，以改善患者临床预后。此外，未来能否通过干预CRC组织中lncRNA CCAT2、NDRG1的表达，抑制癌细胞的肿瘤进展，改善患者生存预后，值得进一步研究。

基金资助:国家自然科学基金项目(81503536);

文章来源:周钰杰,杨芳,严晶,等.结直肠癌组织中lncRNA CCAT2和NDRG1的表达及意义[J].国际检验医学杂志,2024,45(20):2437-2442.