结肠癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率逐年上升，目前常用的抗肿瘤药物治疗副作用较大[1]。天然药物含有多种有效成分，具有多靶点的作用特点，已成为抗结肠癌药物研究的热点[2-4]。南蛇藤是卫矛科南藤蛇属植物，含有萜类、苷类等活性成分，具有抗氧化、抗炎等作用，研究表明南蛇藤提取物可抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭[5]。但南蛇藤提取物对结肠癌的作用相关研究相对较少。研究表明，微小RNA-378(miR-378)在结肠癌中表达降低，上调其表达可抑制癌细胞的侵袭、转移[6]。因此，本研究观察南蛇藤提取物通过调控miR-378对结肠癌细胞生物学的影响。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞

人结肠癌细胞Caco-2,购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。

1.1.2主要药物及试剂

南蛇藤(批号20190203),购于广州致信药业有限公司；注射用环磷酰胺(国药准字H20093032,批号20180618),购于山西普德药业股份有限公司；MTT试剂盒(批号20190215)、细胞凋亡检测试剂盒(批号20190218)、RIRA裂解液(批号20190164),均购于北京索莱宝科技有限公司；TRIzol试剂盒(批号20190406),购于美国Thermo Fisher Scientific公司；反转录试剂盒(批号20190118)、SYBR Green qPCR Mix试剂盒(批号20190123),均购于购自天根生化科技(北京)有限公司；miR-NC(序列ACGUAGCGAUCGUAGCU)、miR-378 mimics(序列CGUAGCUAGUCUGA)、anti-miR-NC(序列UAGCUGAUCGUACGU)、anti-miR-378(序列CGUAGCUAGUCGAU),均购于广州市锐博生物科技有限公司；兔抗人Ki67(批号20190108)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)(批号20190211)、MMP-9(批号20190302)、Cleaved-caspase-3抗体(批号20190201)及二抗(批号20190107),均购于美国Santa Cruz公司；Transwell小室(批号20190113),购于美国Corning公司。

1.1.3主要仪器

多功能酶标仪(型号SpectraMax Mini),购于美谷分子仪器(上海)有限公司；流式细胞仪(型号FACSAriaTMFusion),购于美国BD公司；荧光定量PCR仪(型号QuantStudio ),购于美国赛默飞世尔科技公司。

1.2方法

1.2.1南蛇藤提取物制备[7]

称取南蛇藤藤茎120 g,磨成粉状，用95%乙醇提取3 h,共提取3次，回收乙醇后水混悬，比例为1∶1,用石油醚萃取3次，乙酸乙酯萃取3次，回收后减压浓缩，真空冻干得到南蛇藤提取物(2 g),加入二甲基亚砜(DMSO)中溶解，然后根据需求稀释至20、60、180μg/mL。

1.2.2分组及干预方法

Caco-2细胞用含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基中培养，取对数生长期的Caco-2细胞(2.5×105个/mL)接种于6孔板(100μL/孔)中，并分为低、中、高剂量组和阳性对照组、对照组、miR-NC组、miR-378组、anti-miR-NC+高剂量组、anti-miR-378+高剂量组。低、中、高剂量组分别用含有20、60、180μg/mL的南蛇藤提取物的培养基干预24 h,阳性对照组用含环磷酰胺30μmol/L的培养基干预24 h[8],对照组培养基干预24 h。miR-NC组、miR-378组分别用脂质体将miR-NC、miR-378 mimcs分别转染至Caco-2细胞，anti-miR-NC+高剂量组、anti-miR-378+高剂量组分别用脂质体将anti-miR-NC、anti-miR-378转染至Caco-2细胞中，并加入含有180μg/mL南蛇藤提取物的培养基干预24 h。每组细胞设置9个复孔。

1.2.3 MTT检测细胞增殖能力

收集各组Caco-2细胞，按3×103个/孔(150μL/孔)的密度接种于96孔板中，每孔加入MTT溶液20μL,于37℃、5% CO2培养箱中继续培养4 h,弃培养基，各孔加入DMSO溶液150μL,避光振荡孵育5 min,酶标仪测量490 nm处的吸光度(OD)值，计算细胞增殖率。细胞增殖率=(实验组OD-对照组OD)/对照组OD×100%。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡率

用500μL Binding Buffer(含5μL Annexin V-FITC、5μL PI)重悬各组细胞，室温避光孵育10 min,流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 Transwell小室实验检测细胞迁移与侵袭

①迁移实验。Transwell小室的上室加入各组Caco-2细胞(1×105个/mL)200μL,下室加入600μL完全培养基。培养24 h后，多聚甲醛固定穿膜细胞，0.1%结晶紫染色，显微镜下观察迁移细胞数。②侵袭实验。侵袭实验时先用40μL Matrigel稀释液包覆小室的上室，凝固后备用，后续实验与迁移实验相同，显微镜下观察侵袭细胞数。

1.2.6 Western blot检测Ki67、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表达

收集各组细胞，加入RIPA裂解液提取蛋白，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)进行凝胶电泳，并通过湿法转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，然后用5%脱脂牛奶封闭2 h、加入对应一抗(1:1000稀释的Ki67、MMP-2、MMP-9、Cleaved-caspase-3一抗)4℃孵育过夜，再加入二抗室温孵育2 h,最后进行ECL显色、曝光后，以β-actin作为内参蛋白，用Quantity One软件分析目的条带相对表达量。

1.2.7实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-378mRNA表达

取各组细胞，按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA,反转录合成cDNA,取2μL cDNA、正向引物2μL、反向引物2μL、ddH2O 7.2μL、SYBR Green Master Mix 10μL混合，进行qRT-PCR。以U6作为内参吗，用2-ΔΔCt法计算miR-378 mRNA相对表达量。miR-378正向引物序列5'-GGGACTGGACTTGGAGTCA-3',反向引物序列5'-GTGCGTGTCGTGGACTCG-3';U6正向引物序列5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3',反向引物序列5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。

1.3统计学方法

采用SPSS 21.0软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，2组间差异分析采用独立样本t检验，多组间差异分析采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1不同浓度南蛇藤提取物对Caco-2细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

与对照组比较，低、中、高剂量组和阳性对照组细胞增殖率降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05),迁移及侵袭数量减少(P<0.05),且低、中、高剂量组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05),效果呈剂量依赖性；阳性对照组各指标与低、中剂量组比较差异均有统计学意义(P<0.05),与高剂量组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1。

图1不同浓度南蛇藤提取物对Caco-2细胞凋亡、迁移和侵袭的影响

A为流式细胞术检测5组细胞凋亡；B为Transwell小室实验检测5组细胞迁移和侵袭

表1不同浓度南蛇藤提取物对Caco-2细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

2.2不同浓度南蛇藤提取物对Caco-2细胞Ki67、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

与对照组比较，低、中、高剂量组和阳性对照组Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均明显降低(P<0.05),Cleaved-caspase-3蛋白表达水平均升高(P<0.05),且低、中、高剂量组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05),效果呈剂量依赖性；阳性对照组各指标与低、中剂量组比较差异均有统计学意义(P<0.05),与高剂量组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2、图2。

表2不同浓度南蛇藤提取物对Caco-2细胞Ki67、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

图2 5组Ki67、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表达条带图

2.3不同浓度南蛇藤提取物对Caco-2细胞miR-378 mRNA表达的影响

与对照组比较，低、中、高剂量组和阳性对照组miR-378 mRNA表达升高(P<0.05),且低、中、高剂量组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05),效果呈剂量依赖性；阳性对照组miR-378 mRNA表达高于低、中剂量组(P<0.05),与高剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4 miR-378对Caco-2细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及相关蛋白和miR-378 mRNA表达的影响

表3不同浓度南蛇藤提取物对Caco-2细胞miR-378 mRNA表达的影响

与miR-NC组比较，miR-378组细胞增殖率和Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平降低(P<0.05),迁移及侵袭细胞数减少(P<0.05),细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表达水平、miR-378 mRNA表达均升高(P<0.05)。见表4、图3。

2.5抑制miR-378对南蛇藤提取物对Caco-2细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及相关蛋白和miR-378 mRNA表达的影响

与anti-miR-NC+高剂量组比较，anti-miR-378+高剂量组细胞增殖率和Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平升高(P<0.05),迁移及侵袭细胞数增多(P<0.05),凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表达水平、miR-378 mRNA表达降低(P<0.05)。见图4、表5。

表4 miR-378对Caco-2细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及相关蛋白和miR-378 mRNA表达的影响

图3 miR-378对Caco-2细胞凋亡、迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响

图4抑制miR-378对南蛇藤提取物对Caco-2细胞凋亡、迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响

表5抑制miR-378对南蛇藤提取物对Caco-2细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及相关蛋白和miR-378 mRNA表达的影响

3、讨论

目前手术、化疗等综合治疗方式治疗结肠癌的效果不佳，药物毒副作用较大且易出现肿瘤耐药性，患者预后未得到明显改善，针对结肠癌的药物研究成为热点。既往研究显示，天然药物具有抗结肠癌作用，并可通过调控多种途径或多靶点而发挥作用[9-12]。

中医学认为，结肠癌属本虚标实之证，虚以脾虚为主，多兼有痰、湿、热、瘀、毒等标实，湿、痰、毒、瘀互结，蕴结肠腑，瘀滞肠络，形成积块。南蛇藤可祛风除湿，通经止痛，活血解毒。研究证实，南蛇藤提取物可抑制胃癌细胞增殖及诱导细胞周期阻滞[13],还可抑制食管鳞癌细胞增殖、促进细胞凋亡从而发挥抗食管鳞癌作用[14]。本研究结果显示，南蛇藤提取物处理后结肠癌Caco-2细胞凋亡率升高，增殖率降低，迁移及侵袭细胞数减少，提示南蛇藤提取物可诱导结肠癌细胞凋亡，并抑制其增殖、迁移及侵袭。研究显示，Ki67是一种与细胞周期相关的增殖细胞核蛋白，其表达上调可促进细胞增殖[15];MMP-2、MMP-9参与血管重塑、血管生成、肿瘤侵袭等过程，其表达上调能诱导肿瘤转移[16];而Cleaved-caspase-3是调节细胞凋亡的关键介质，其表达增加可诱导细胞凋亡[17]。本研究中南蛇藤提取物处理后，结肠癌Caco-2细胞中Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平降低，Cleaved-caspase-3蛋白水平增加，进一步证实南蛇藤提取物能通过调节增殖、凋亡及迁移、侵袭标志蛋白表达而抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡。

miR-378在胶质瘤细胞和组织中表达下调，其表达量与胶质瘤患者预后有关，上调miR-378表达可抑制胶质瘤细胞转移和裸鼠移植瘤生长[18]。过表达miR-378可抑制胃癌细胞周期进程[19]。本研究结果显示，南蛇藤提取物可提高结肠癌Caco-2细胞中miR-378 mRNA的表达量，提示南蛇藤提取物可能通过上调miR-378 mRNA的表达而发挥抗结肠癌作用。为进一步证实miR-378对结肠癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响，本研究在Caco-2细胞中转染miR-378模拟物(miR-378 mimcs)及其阴性对照，结果发现，过表达miR-378可通过下调Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表达而抑制Caco-2细胞增殖、迁移和侵袭，并通过上调Cleaved-caspase-3蛋白表达促进Caco-2细胞凋亡。为探讨南蛇藤提取物对结肠癌细胞中miR-378的调节作用，本研究在转染miR-378抑制剂(anti-miR-378)及阴性对照的Caco-2细胞中加入高剂量南蛇藤提取物进行培养，结果显示，转染anti-miR-378并用高剂量南蛇藤提取物培养后，细胞增殖率、迁移细胞数、侵袭细胞数和Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平升高，细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平降低，表明抑制miR-378表达可减弱南蛇藤提取物对结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用和对凋亡的促进作用。提示miR-378可能为南蛇藤提取物治疗结肠癌的潜在靶点。

综上所述，南蛇藤提取物可通过上调miR-378表达来促进结肠癌细胞凋亡，抑制其增殖、迁移及侵袭，为抗结肠癌药物的研发提供了新方向。但南蛇藤提取物是否能通过调控其他miRNA或信号通路而发挥抗结肠癌作用尚需进一步探究。

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文章来源:王威,邓瑞,周培华.南蛇藤提取物通过调控微小RNA-378对结肠癌细胞生物学行为的影响[J].河北中医,2024,46(12):2017-2023.