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下调CD151联合贝伐珠单抗抑制结直肠癌生长与微血管密度

2024-12-30 80 上传者：管理员

摘要：目的研究下调CD151表达联合应用贝伐珠单抗对结直肠癌生长以及微血管密度的影响。方法用贝伐珠单抗分别处理人结肠癌细胞系HT-29以及CD151--HT-29株（下调CD151的HT-29细胞）,最终将细胞分为4组：HT-29对照组，贝伐珠单抗处理组，CD151--HT-29组，CD151--HT-29+贝伐珠单抗处理组，通过细胞增殖活性实验（MTS法）观察各组细胞的增殖情况；制作裸鼠皮下移植瘤模型，HT-29对照组以及CD151--HT-29组分别采用0.9%氯化钠溶液、贝伐珠单抗治疗。观察4组裸鼠皮下瘤的生长情况，并记录皮下瘤的体积和质量；取各组成瘤裸鼠的肿瘤组织，通过标记血管内皮标志物，以免疫组化方式考察各组肿瘤组织的微血管密度（MVD）水平。结果与对照组相比，贝伐珠单抗处理组以及CD151--HT-29组细胞的增殖显著降低（P<0.001）;CD151-联合应用贝伐珠单抗组细胞增殖比单一处理组细胞增殖慢（P<0.001）;在裸鼠皮下瘤实验中，贝伐珠单抗处理组以及CD151-组裸鼠皮下瘤体积、质量及MVD,与对照组相比显著降低（P<0.01）;CD151-+贝伐珠单抗组裸鼠皮下瘤体积、质量以及CD34表达，与单一处理组相比显著降低（P<0.01）。结论 CD151蛋白可能参与结直肠癌组织中血管生成的调控，并与靶向药物在瘤组织微血管生成方面有一定的协同作用。

关键词：
CD151
TM4SF
微血管密度
结直肠癌
贝伐珠单抗
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结直肠癌的发生率和致亡率在中国逐年上升，其中转移性的结直肠癌是这类患者死亡的主要原因之一[1]。在结直肠癌进展中，血管生成扮演着重要的角色，它对结直肠癌的早期发展、侵袭以及转移具有重要影响，是结直肠癌治疗的主要靶点之一[2]。目前许多靶向药物可以拮抗血管生成，如贝伐珠单抗(bevacizumab)等一系列药物，已投入临床治疗当中，丰富了转移性结直肠癌患者的治疗手段[3]。贝伐珠单抗可特异性阻断血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)与其受体的结合，抑制血管生成，阻碍肿瘤的生长转移。研究证明，贝伐珠单抗联合化疗疗法在多种肿瘤中的疗效优于单一疗法效果[4]。据报道，CD151蛋白分子是4次跨膜蛋白超家族(transmem-brane 4 superfamily, TM4SF)成员之一，可以调控结直肠癌肿瘤的血管生长，对细胞的增殖、侵袭、转移等有抑制作用[5]。然而，下调CD151蛋白能否协同贝伐珠单抗增强抗肿瘤疗效尚不清楚。

本研究以结肠癌细胞系HT-29为模型细胞，在细胞和动物水平上，考察下调CD151蛋白与贝伐珠单抗联合疗法对结直肠癌的治疗作用，探讨该联合应用疗法能否提高疗效，从而揭示CD151蛋白在结直肠癌发展过程中所起的作用。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：

BALB/c雄性裸小鼠40只，周龄为4～5周，体质量为24～26 g, 来自河北医科大学动物中心。

1.1.2 细胞系：

商品化人结肠癌细胞系HT-29及CD151敲低的HT-29细胞株(CD151--HT-29)均由河北中医学院药理学张伟老师惠赠。

1.1.3 主要试剂：

贝伐珠单抗(上海罗氏制药有限公司);DAB显色试剂盒(北京索莱宝科技公司);HRP标记的二抗试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);CD151兔抗人单克隆抗体、CD34兔抗人单克隆抗体(Epitomics公司);ECL发光试剂盒(北京全式金生物技术公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：

使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基),在37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养。待细胞贴壁生长，汇合度约80%时使用胰蛋白酶消化，800 ×g离心5 min, 使用完全培养基重悬，转移至新培养皿中，每24 h换液。当细胞处于对数生长期时，进行实验。

1.2.2 MTS法增殖实验：

将HT-29对照组细胞、CD151--HT-29细胞用胰蛋白酶消化，接种于96孔板，设置HT-29对照组，贝伐珠单抗处理组，CD151--HT-29组，CD151-+贝伐珠单抗处理组，每组设6个复孔，每孔加0.1 mL(细胞数约1×103个)。待细胞贴壁后给予贝伐珠单抗处理。连续5 d, 每天倒掉培养基，加入10%的MTS溶液0.1 mL,置于5% CO2、温度为37 ℃的培养箱内孵育2 h, 用酶标仪测定492 nm处吸光度值。

1.2.3 Western blot实验：

提取蛋白质，BCA方法测定蛋白质浓度，提取的蛋白质加loading buffer煮沸5 min, 调整上样量(保持内参一致),上样，电泳，转膜，BSA封闭液封闭1 h, 一抗杂交孵育，4 ℃冰箱过夜，PBST洗涤3次，二抗杂交孵育1～2 h, PBST洗涤3次，曝光。

1.2.4 实时定量PCR测定CD151的mRNA的表达：

取对数生长期的HT-29、CD151--HT-29细胞，分别加入1 mL Trizol, 吹打至细胞裂解后转移至离心管中，10 000×g离心，取上清液，加入0.2 mL氯仿，混匀静置15 min, 离心取上清，加入等体积异丙醇，混匀离心，取沉淀，得到总RNA。将总RNA反转录生成cDNA文库。将CD151的引物(正向：5′-GGG CCACTTGCATGTTCGT-3′,反向：5′-CAGGTTCCACT TGAGCTTGTTCAC-3′)用重蒸水溶解为10 pmol/μL母液，取各引物1 μL,与12.5 μL cDNA、2 μL cDNA和8.5 μL的重蒸水混合，进行PCR反应(94 ℃预变性4 min、94 ℃变性0.5 min、56 ℃复性0.5 min、72 ℃延伸1 min, 循环40次扩增)。用2-△△Ct法计算目的基因的表达量。

1.2.5 裸鼠组别及处理：

对20只裸鼠皮下接种HT-29,20只裸鼠接种等量CD151--HT-29,等瘤体平均直径到达4 mm后，2组裸鼠中各取10只裸鼠分别进行0.9%氯化钠溶液以及贝伐珠单抗处理；5 mg/kg/次，腹腔注射，每2周给药1次。空白组给予等量0.9%氯化钠溶液。观察裸鼠的日常生活状况。给药14 d后，断颈处死裸鼠，将肿瘤组织部分放于10%福尔马林液固定，部分放入无RNA酶的离心管中，-80 ℃冰箱保存备用，记录每只裸鼠皮下瘤体积(表1)。

1.2.6 免疫组化法考察微血管密度：

以CD34抗体标记血管内皮细胞，在显微镜下观察肿瘤微血管密度(microvessel density, MVD)。阳性判断标准：DAB染液染色切片，血管内皮细胞胞质为棕色、细胞核为蓝色。10倍物镜下圈定3个热点(即微小血管密集区),再以20倍物镜计数每个热点中的微血管数(大血管除外),MVD即为3个热点中微血管的平均数(个/高倍视野)。

1.3 统计学分析

使用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，计量资料以均数±标准差

表示，组间比较采用非参数秩和检验，显著性水平设定为P<0.05。

2、结果

2.1 CD151--HT-29模型确证

与HT-29对照组细胞相比，在CD151--HT-29细胞当中，CD151的mRNA显著下降(P<0.001),蛋白水平也明显降低(图1)。

2.2 CD151表达抑制与贝伐珠单抗对结直肠癌细胞的生长具有协同抑制作用

相对于HT-29对照组细胞，贝伐珠单抗处理组以及CD151-组细胞的增殖明显减慢，而CD151-+贝伐珠单抗组细胞的增殖最慢(P<0.001)(图2)。

2.3 CD151表达抑制与贝伐珠单抗对结直肠癌裸鼠皮下移植模型具有协同抑制作用

裸鼠一般情况良好，40只裸鼠于细胞皮下接种4～7 d均成瘤，随着肿瘤的生长，贝伐珠单抗处理组以及联合治疗组裸鼠活动明显较其他组减少，精神差，饮食减少。4组裸鼠皮肤粗糙，皮下脂肪减少，至实验结束，4组裸鼠均未死亡。

图1 CD151在CD151--HT-29细胞比HT-29细胞中表达降低

图2 MTS法测定不同组别HT-29处理120小时的细胞增殖曲线

各组裸鼠肿瘤的体积和质量对比情况如表1所示，相对于HT-29对照组，贝伐珠单抗处理组以及CD151--HT-29组的肿瘤体积及质量明显减小，而CD151-+贝伐珠单抗处理组肿瘤的体积及质量最小。

2.4 CD151表达抑制与贝伐珠单抗对结直肠癌裸鼠皮下移植模型的微血管密度表达水平具有协同抑制作用

肿瘤细胞呈团巢状分布，具有腺癌的组织学特征，染色质深染，可见核分裂象。单一条件处理后，与对照组相比，各组肿瘤微血管密度均降低(P<0.05);而相对于单一处理组，CD151-+贝伐珠单抗组的肿瘤微血管密度显著降低(P<0.05)(图3,表2)。

表1 HT-29裸鼠皮下移植模型经历不同处理后的肿瘤体积和质量

表2 免疫组化法统计4组裸鼠皮下移植瘤的MVD (微血管密度)对比

3、讨论

众所周知，在肿瘤的生长以及转移过程中，血管生成有着重要作用[6]。鉴于其在肿瘤进展中的关键作用，血管生成机制研究逐渐成为热点。CD151在多种肿瘤组织中高表达，与血管生成息息相关[7-10];在结直肠癌中，CD151也呈高表达，且与淋巴结转移及预后呈正相关[11]，关于CD151与结直肠癌的血管生成之间的关系却鲜有报道。本研究结果不仅证明，下调CD151可抑制结直肠癌的进程，而且发现CD151与其血管生成过程紧密关联，提示干预CD151有望成为结直肠癌治疗靶点的潜力。

图3 不同组别裸鼠肿瘤中CD34的免疫组化图[(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，SP)连接法]

抗血管生成类靶向药物通过与VEGF的受体结合，阻断受体二聚体形成和酪氨酸磷酸化过程，抑制下游激酶级联信号的传输通路，阻止肿瘤血管新生的进程，从而达到抗肿瘤目的[12-13],其中贝伐珠单抗就是代表性药物中的一员。许多的研究表明贝伐珠单抗治疗的优势，然而贝伐珠单抗也存在一定的药物毒性[14]。本研究结果表明，抑制CD151的表达联合应用贝伐珠单抗的治疗能达到协同效果，这为未来减少贝伐珠单抗的副作用提供了一个研究方向。

血管的新生是肿瘤生长、侵袭和转移等过程的中心环节，以肿瘤血管生成为靶点已成为治疗的新策略，但肿瘤血管生成的分子机制十分繁复，多种生长因子及其信号通路在肿瘤血管生成中起重要作用。本研究从CD151及血管生成二者之间的关系中探索血管生成机制的新线索，为结直肠癌的治疗提供新的靶点，从而给广大结直肠癌患者带来福音，敲掉CD151的移植瘤组织的微小血管密度明显下降，提示CD151可以促进血管生成。

从分子生物学的研究成果来看，肿瘤的侵袭和转移是由肿瘤细胞的多种基因通过多个步骤复杂调控的有计划的入侵行为，该过程不但涉及肿瘤和靶部位的相互作用，还涉及一系列相关基因的功能异常[15]。本研究验证了CD151对结直肠癌细胞生长以及血管生成具有促进作用，现CD151的研究仍处于一个初级阶段，需进一步明确研究探讨CD151在肿瘤生长及转移的作用机制，从而使CD151在结直肠癌治疗得到补充和完善，更多的结直肠恶性肿瘤患者将从中获益。

参考文献:

[12]刘星洲,涂水平.贝伐珠单抗治疗结直肠癌的耐药机制研究进展[J].医学综述,2017,23:2972-2977.

[13]王静斋,肖莉杰.贝伐珠单抗仿制药生物活性测定方法的开发与应用[J].中国医药生物技术,2018,13:276-280.

[15]邱禹杉,李隆敏,许桐瑛,等.Annexin A2与肿瘤侵袭和转移关系的研究进展[J].现代肿瘤医学,2017,25:2152-2155.

基金资助:衡水市科技计划项目(2016014054Z);河北省科技计划项目(13397708D);

文章来源:刘艳彩,刘学刚,张振亚.下调CD151联合贝伐珠单抗抑制结直肠癌生长与微血管密度[J].基础医学与临床,2025,45(01):20-24.