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结直肠癌KRAS基因突变与临床病理及实验室特征的关系分析

2025-01-02 148 上传者：管理员

摘要：目的探讨结直肠癌患者克尔斯滕大鼠肉瘤(KRAS)基因突变情况与其临床病理及实验室特征的关系。方法 KRAS基因突变检测采用突变扩增系统PCR(ARMS-PCR),将297例结直肠癌患者根据KRAS基因突变情况分为KRAS野生型(KRAS-WT)组与KRAS突变型(KRAS-MT)组。收集患者性别、年龄、原发部位、转移浸润、TMN分期、病理类型、分化程度、免疫组织化学及血清肿瘤标志物等资料，并进行统计学分析。结果 297例结直肠癌患者中，KRAS基因总突变率为47.81%(142/297),其中第2号外显子上的位点突变率最高，占35.69%(106/297)。与KRAS-WT组比较，KRAS-MT组原发部位为右半结肠及女性患者占比更高(P<0.05)。第2号外显子突变组、第3、4号外显子突变组和KRAS-WT组在Ki67阳性细胞比例方面比较，差异有统计学意义(P<0.05)。第2号外显子突变组、第3、4号外显子突变组和KRAS-WT组血清CEA、CA199水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论结直肠癌中KRAS基因突变类型与患者不同临床病理与实验室特征之间存在一定的相关性，可为结直肠癌临床诊疗提供线索。

关键词：
CRC
KRAS
临床病理特征
恶性肿瘤
结直肠癌
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结直肠癌(CRC)是消化系统常见恶性肿瘤，据统计我国CRC发病率和病死率分别居恶性肿瘤的第2位和第4位，并呈逐年上升趋势[1-2]。研究表明CRC是一种多基因参与、多步骤积累、具有高度时空异质性的疾病，克尔斯滕大鼠肉瘤(KRAS)基因突变所参与的表面生长因子受体(EGFR)下游MAPK信号通路持续激活被证明在肿瘤细胞异常增殖过程中发挥了重要作用[3-4]。晚期复发性或转移性CRC(mCRC)是临床治疗的难点，除了常规手术、放化疗方案，基于分子检测的抗EGFR靶向治疗已成为重要治疗手段，2022年最新版美国国立综合癌症网络(NCCN)指南明确指出拟使用抗EGFR单抗前须明确KRAS基因状态[5],当前关于KRAS G12C等位基因等相关分子的特异性抑制剂的开发更将靶向KRAS基因的研究推向了一个新的水平[6]。

KRAS基因作为CRC中最常见的突变癌基因，其不同突变表型可能影响CRC免疫表型及功能状态的异质性，从而使患者表现出不同的临床病理及实验室特征。本研究通过分析CRC患者的KRAS基因突变情况及其与临床病理和实验室特征的关系，旨在为探索CRC发病机制与靶向治疗中的潜在分子靶点提供理论依据，以便于临床上针对特定CRC患者亚群的肿瘤生物学特征进行精确诊断及个体化治疗。

1、资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年2月至2023年2月华中科技大学同济医学院附属同济医院收治的CRC患者为研究对象，最终入组患者297例。纳入标准：(1)符合《结直肠癌诊疗指南2023》[7]中CRC的诊疗规范；(2)组织病理学、影像学检查明确为原发性CRC;(3)已接受KRAS基因突变检测。排除标准：(1)遗传性CRC或具有可疑CRC家族遗传史；(2)多发性恶性肿瘤。收集297例CRC患者的完整临床病理及实验室资料，包括性别、年龄、肿瘤原发部位、肿瘤最大径、转移浸润、TMN分期、病理类型、分化程度、免疫组织化学，以及常规检验指标[血常规、凝血功能、血生化、C反应蛋白(CRP)、血清肿瘤标志物]等。本研究经华中科技大学同济医学院附属同济医院医学伦理委员会批准(TJ-JRB202402116),基因突变检测取得患者本人或其家属的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 突变扩增系统PCR检测KRAS基因突变情况

(1)组织DNA提取：选取3～5张5 μm厚的石蜡包埋的CRC组织切片，严格按照甲醛水溶液固定石蜡包埋样品分离试剂盒说明书(恺硕生物科技股份有限公司)提取基因组DNA。(2)基因突变检测：使用人类KRAS、NRAS、BRAF基因突变联合检测试剂盒(厦门艾德生物医药科技股份有限公司),标本DNA的稀释、配制、加样、反应循环参数及结果判读均严格按照试剂盒说明书进行。每次反应均设定各种基因突变的阳性及阴性对照。PCR仪为ABI 7500荧光定量PCR仪。检测包括KRAS基因第2、3、4号外显子，NRAS基因第2、3、4号外显子和BRAF基因第15号外显子的体细胞基因突变情况。

1.2.2 免疫组织化学染色及结果判定

(1)使用全自动免疫组织化学染色系统-UltraPATH(北京中杉金桥生物技术有限公司)完成切片的脱蜡、水化、抗原修复至免疫组织化学染色成片。抗体信息如下：MLH1兔单抗、PMS2兔单抗、MSH2兔单抗、MSH6兔单抗、Ki67兔单抗、CDX2兔单抗、P53鼠单抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);(2)观察染色强度，根据有无着色分为阳性表达和阴性表达。MLH1、PMS2、MSH2、MSH6为错配修复(MMR)蛋白，至少1种错配修复蛋白表达阴性为错配修复功能缺陷，4种错配修复蛋白表达阳性为错配修复功能完整；Ki67按照阳性细胞比例分为≤40%、>40%～70%、>70% 3组。

1.3 分组情况

297例患者中KRAS基因野生型占比52.19%(155/297),KRAS基因突变型占比47.81%(142/297),第2号外显子位点突变发生率为35.69%(106/297),第3、4号外显子位点突变发生率为12.12%(36/297)。根据KRAS基因突变情况，将CRC患者分为KRAS野生型(KRAS-WT)组(155例)和KRAS突变型(KRAS-MT)组(142例),根据突变位点所在外显子将KRAS-MT组进一步分为第2号外显子突变组(106例)和第3、4号外显子突变组(36例)。

1.4 统计学处理

采用SPSS25.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以

表示，组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示，组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验；计数资料以频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 297例CRC患者整体临床病理特征

297例CRC患者中，男172例(57.91%),女125例(42.09%);中位年龄58岁，>60岁116例(39.06%),≤60岁181例(60.94%);原发部位：左半结肠140例(47.14%),右半结肠130例(43.77%),直肠22例(7.41%),不明5例(1.68%);TNM分期：Ⅱ期71例(23.91%),Ⅲ期105例(35.35%),Ⅳ期117例(39.39%),不明4例(1.35%);病理类型：腺癌235例(79.12%),黏液腺癌62例(20.88%);远处转移：腹膜转移25例(8.42%),肝转移79例(26.60%),其他部位转移12例(4.04%),无转移178例(59.93%),不明3例(1.01%);分化程度：低分化68例(22.90%),中分化151例(50.84%),高分化23例(7.74%),缺失55例(18.52%);P53:阳性134例(45.12%),阴性94例(31.65%),缺失69例(23.23%);Ki67≤40% 19例(6.40%),40%<Ki67≤70% 122例(41.08%),Ki67>70% 94例(31.65%),缺失62例(20.88%)。

2.2 KRAS-WT组和KRAS-MT组临床病理特征比较

与KRAS-WT组比较，KRAS-MT组原发部位为右半结肠及女性患者占比更高(P<0.05)。见表1。

表1KRAS-WT组和KRAS-MT组临床病理特征比较[n(%)]

2.3 KRAS突变类型与CRC患者免疫组织化学特征的关系分析

第2号外显子突变组、第3、4号外显子突变组和KRAS-WT组在Ki67阳性细胞比例方面比较差异有统计学意义(P<0.05),第2号外显子突变组和KRAS-WT组Ki67>70%占比、40%<Ki67≤70%占比均高于第3、4号外显子突变组(P<0.05),第3、4号外显子突变组Ki67≤40%占比高于第2号外显子突变组和KRAS-WT组(P<0.05)。3组P53、CDX2、MLH1、MLH2、MLH6、PMS2、MMR特征比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4 KRAS突变类型与CRC患者血清肿瘤标志物水平的关系分析

第2号外显子突变组，第3、4号外显子突变组和KRAS-WT组血清CEA、CA199水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05),第3、4号外显子突变组CEA水平高于KRAS-WT组(P<0.05),第3、4号外显子突变组、第2号外显子突变组CA199水平高于KRAS-WT组(P<0.05),血清CA724水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 3组免疫组织化学特征对比[n(%)]

表3 3组血清肿瘤标志物特征对比[M(P25,P75)]

3、讨论

CRC作为一种高度异质性的肿瘤，其发病机制涉及多种基因改变和多种途径，其中EGFR与CRC的发生发展密切相关[8-9],KRAS基因编码的kras蛋白是一种GTP酶，参与EGFR的信号转导，调控细胞生长、分化、增殖和存活，KRAS基因突变导致kras蛋白的组成性激活，持续刺激下游MAPK信号通路并诱导肿瘤细胞的增殖分化[10-11],靶向EGFR的单克隆抗体已被证明有益于难治性CRC患者，然而对于携带KRAS基因突变的患者治疗疗效却不佳[6,12]。有文献报道，约40%～50%的CRC患者携带导致KRAS激活的错义突变，其中大多数发生在密码子12、13和61处[6]。本研究中，KRAS基因突变发生率为47.81%,其中第2号外显子突变发生率最高，占KRAS基因突变总发生率的74.65%(106/142),突变位点主要发生在第2号外显子的第12、13位密码子上，与上述文献报道基本一致。

关于CRC患者KRAS基因突变与临床病理特征之间关系的研究结论并不完全一致，争议的焦点主要集中在肿瘤原发部位、性别和年龄上，研究结论的差异可能是由于种族、地域、样本量及检测方法等的限制。ALJEHANI等[13]和谢明智等[14]的研究指出，KRAS基因突变在肿瘤原发部位为右半结肠的CRC患者中较为频繁，而在肿瘤原发部位为左半结肠的CRC患者中突变频率较低；刘威等[15]研究结果表明，KRAS基因突变的CRC患者肿瘤原发部位多为左半结肠，pMMR、高中分化腺癌患者比例更高；本研究发现，与KRAS-WT组比较，KRAS-MT组原发部位为右半结肠及女性患者占比更高(P<0.05)。左、右半结肠癌及直肠癌由于存在胚胎起源、解剖学供应、遗传学及分子生物学特征上的差异，导致其流行病学和致癌机制不同，且靶向治疗效果及预后各异。该结论提示不同性别、不同原发部位的CRC患者生存率可能存在一定的差异，同时可为采用分子分型方法对不同类型的CRC进行早期诊断提供一定思路。

Ki67是由位于第10号染色体上的MKi-67基因所编码参与核糖体RNA合成的核蛋白，是一种肿瘤细胞增殖标志物，与多种肿瘤的发生发展、转移及预后密切相关[16],LOU等[17]的一项纳入6 180例CRC患者的meta分析显示，Ki67高表达是患者总生存期和无病生存期的独立危险因素。本研究结果显示，第2号外显子突变组及第3、4号外显子突变组和KRAS-WT组在Ki67阳性细胞比例方面比较，差异有统计学意义(P<0.05),第2号外显子突变组和KRAS-WT组Ki67>70%占比、40%<Ki67≤70%占比均高于第3、4号外显子突变组(P<0.05)。这提示KRAS基因第2号外显子上相关密码子的突变可能与CRC患者肿瘤低分化、远处转移和生存率低有关。

CEA是具有人类胚胎抗原特异性决定簇的大分子多糖蛋白，CA199是一种低聚糖类肿瘤相关糖类抗原，二者在临床中常被作为胃肠道肿瘤检测的血清标志物，在CRC的诊断、判断复发与转移中具有重要临床意义[18-19]。本研究发现，第3、4号外显子突变组CEA水平高于KRAS-WT组(P<0.05),第3、4号外显子突变组、第2号外显子突变组CA199水平高于KRAS-WT组(P<0.05),这与JONES等[20]的研究结果相似。这些结果提示与未携带KRAS基因突变的CRC患者相比，携带KRAS基因突变的CRC患者肿瘤复发和转移的风险可能更高，KRAS基因突变具有作为CRC患者生存预后评价指标的潜力。

综上所述，本研究回顾性分析了近5年就诊于本院的297例CRC患者的KRAS基因突变情况，并对CRC患者KRAS基因表型与临床病理特征及实验室指标进行了关系分析，发现KRAS基因突变的CRC患者原发部位为右半结肠、女性、Ki67>70%患者占比更高，血清肿瘤标志物CEA、CA199水平更高。KRAS基因突变与CRC患者部分临床病理及实验室特征存在一定联系，但需更多病例研究进一步证实；KRAS基因突变在CRC发生、发展过程中的作用机制及抗EGFR靶向治疗的效果评价和预后情况也有待进一步研究。

参考文献:

[7]中国临床肿瘤学会指南工作委员会.结直肠癌诊疗指南2023[M].北京:人民卫生出版社,2023:1-132.

[14]谢明智,李科志,利基林,等.结直肠癌KRAS和BRAF基因突变及其与临床病理的相关性[J].广东医学,2019,40(8):1128-1131.

[15]刘威,王菲,杜洪,等.KRAS､BRAF基因突变的结直肠癌患者临床病理特征分析[J].广州医科大学学报,2021,49(4):13-18.

[19]赵爽,王彬潘,阳莎,等.外周血炎症相关指标联合癌胚抗原对结直肠癌的诊断价值[J].国际检验医学杂志,2022,43(5):513-518.

文章来源:巴琴文,袁旭,王云,等.结直肠癌KRAS基因突变与临床病理及实验室特征的关系分析[J].国际检验医学杂志,2024,45(24):3030-3034.