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ctDNA在结直肠癌诊断中的应用进展

2020-09-27 545 上传者：管理员

摘要：结直肠癌是世界范围内最为常见的恶性肿瘤之一，早期诊断对于结直肠癌治疗具有重要意义。目前结直肠癌筛查的主要方法包括直肠指检，肠镜和粪便隐血试验等，但这些检测方法具有一定的缺点，基于血液样本的液体活检方法逐渐受到关注。循环肿瘤DNA因其独特生物学特性成为结直肠癌患者潜在的血循环生物标记物，本文将关注ctDNA在结直肠癌诊断方面的应用。

关键词：
循环肿瘤DNA
恶性肿瘤
液体活检
筛查诊断
结直肠癌
肠镜
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结直肠癌在世界范围内是最为常见的肿瘤之一，根据2018年全球癌症报告，结直肠癌新发病例占全部病例的6.1%，位居第四位[1]。在我国，报告显示2015年中国结直肠癌发病人数和死亡人数均位居第五位[2]。研究显示，结直肠癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的五年生存率分别为81.2%、71.7%、58.4%和14.4%[3]，然而由于发病隐匿，早期症状不明显，尽管早期结直肠癌患者拥有较高的五年存活率，但只有30%-40%患者在结直肠癌早期被确诊，60%-70%患者直到晚期时才能被确诊[4]。因此，结直肠癌的早期筛查及诊断具有重要意义。然而报道显示，在美国，2018年50岁至54岁人群筛查率仅为48%,55岁至64岁人群中的筛查率也只有68%[5]。目前，美国癌症协会建议50岁以上人群定期进行结直肠癌筛查，包括：每年进行一次粪便免疫化学试验，高灵敏度粪便隐血试验每年一次，多靶点粪便DNA检测每3年一次，结肠镜检查每10年一次，CT结肠造影每5年一次，柔性乙状结肠镜检查每5年一次[6]。然而这些检查大多是侵入性的，具有有创性，无法进行长期检测，患者依从性不佳，且由于肿瘤的异质性，单一组织样本难以反映肿瘤的整体情况等缺点。除此之外，有研究表明与粪便标本相比78%患者更愿意提供血液样本[7]。因此，目前越来越多的研究投入到寻找基于血液样本的结直肠癌诊断方法，人们通常称之为液体活检（Liquidbiopsy）。本文就ctDNA在结直肠癌诊断应用研究进展进行综述。

1、ctDNA的生物学特性

血液中含有许多有潜力用作生物标记物的物质，包括蛋白质、外泌体、核小体、循环癌细胞和循环肿瘤DNA等[8]。其中，循环肿瘤DNA正逐渐受到人们关注。1948年，Mandel和Métais首次在人类血液中发现了非细胞游离核酸（CellfreeDNA,cfDNA)[9]。cfDNA是在血液、粪便、尿液或唾液中均可发现的游离于细胞外的基因片段，它由核酸链组成，核酸链来源于多种细胞，包括但不限于肿瘤细胞。1989年，Stroun等通过比较DNA链的热力学稳定性，首次证实肿瘤患者外周血中的一部分cfDNA来源于肿瘤细胞，称之为ctDNA[10]。ctDNA是cfDNA中来源于肿瘤细胞的部分，由肿瘤凋亡、坏死，或循环肿瘤细胞裂解产生，但其具体机制尚不清楚[4]。Gasparello等用LoVo和LS174T两种细胞系进行了体内和体外实验，结果显示在体外LoVo细胞系比LS174T细胞更有效地释放ctDNA，而相反当这些肿瘤细胞作为异种移植物在小鼠体内生长时，LS174T细胞系在血液中ctDNA含量更加丰富，且这种差别与“管家”因素无关，如细胞增殖，肿瘤异种移植物的生长，坏死或微血管密度。显示在细胞和全身两个方面存在有两种不同的途径影响ctDNA的释放[11]。

ctDNA长度在166bp左右[12]，半衰期从15分钟到几个小时不等，通常被肾脏、肝脏和脾脏迅速清除。淋巴系统和血液的各种生理过滤（清除、降解等）也决定了血液循环中ctDNA的数量[13]。不同类型肿瘤ctDNA检出率不同，Bettegowda等报道结直肠癌、胃食管癌、胰腺癌和乳腺癌患者中ctDNA的检出率分别为73%、57%、48%和50%；不同分期患者ctDNA检出率也不同，有47%的Ⅰ期癌症患者可检出ctDNA，而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期癌的ctDNA检出率分别为55%、69%和82%[14]。ctDNA的特征在于存在癌症相关的遗传和表观遗传突变，例如点突变，基因组序列重排，拷贝数变异，微卫星不稳定性，杂合性缺失和DNA甲基化[15]。这些特征有助于将它们与剩余cfDNA片段区分开来，从而使ctDNA成为能够用于早期诊断与筛查，监测疾病状态、进展和复发的潜在生物标志物。

2、ctDNA在结直肠癌诊断应用

目前，已有多项研究阐释了ctDNA作为生物标记物用于结直肠癌诊断的价值。Yu等研究发现结直肠癌患者血液中ctDNA含量高于健康人，患者ctDNA样本与肿瘤组织样本的KRAS和BRAF基因突变一致性为92%[16]。Yang等研究发现结直肠癌患者血液ctDNA浓度随肿瘤大小增加而增加，I期与IV期患者之间ctDNA浓度具有显著差异。ctDNA的检出率高于目前5种常用肿瘤生物标志物，包括癌胚抗原、甲胎蛋白、糖类抗原19-9、癌抗原125(Cancerantigen125,CA125）、癌抗原72-4。Hsu等检测了32例结直肠癌患者的ctDNA样本和肿瘤组织样本中的基因变异，发现他们之间的一致性很高（85%），且ctDNA水平的变化与肿瘤缩小显著相关；与ctDNA下降<80%的患者相比，治疗后ctDNA下降>80%的患者无进展生存期更长（HR,0.22)[18]。He等研究发现结直肠癌的分期、大小、浸润深度与检测灵敏度呈正相关，而不同部位的肿瘤间检测灵敏度无差异。浸润性结直肠癌比溃疡性和突出性结直肠癌表现出更高的敏感性，而不同组织学类型之间的敏感性没有差异。有远处转移的结直肠癌（M1）比无远处转移的结直肠癌有更高的敏感性，而有淋巴结转移的结直肠癌（N1和N2）与无淋巴结转移的结直肠癌相比无统计学意义[19]。可见，ctDNA检测相比其它常用肿瘤生物标志物具有优势，且能一定程度反应肿瘤负荷和肿瘤状态，在结直肠癌早期诊断应用前景广泛。

对ctDNA进行基因检测亦能用于结直肠癌早期诊断。Luo等对1493名结直肠癌高危人群进行的一项前瞻性队列研究，发现ctDNA甲基化标记cg10673833检测确定21例结直肠癌患者中的19例，8例原位结直肠癌患者中的7例，敏感性为89.7%(95%CI,0.727～0.978），特异性为86.8%(95%CI,0.849～0.884),AUC为0.90(95%CI,0.885～0.942）；对晚期癌前病变的敏感性为33.3%(95%CI,0.231～0.449），远高于无癌或晚期癌前病变的阳性率（12.1%;95%CI,0.101～0.139），有望成为一种有效的非侵入性的结直肠癌筛查工具[20]。Church等研究发现了ctDNA中SEPT9基因甲基化检测敏感度为48.2%(95%CI32.4%～63.6%）；结直肠癌Ⅰ～Ⅳ期分别为35.0%、63.0%、46.0%和77.4%；特异性91.5%(95%CI89.7%～93.1%），显示其在结直肠癌筛查或诊断中的价值[21]。Cohen等人描述了一种多分析物试验（CancerSeek），通过评估循环中蛋白和ctDNA突变水平，检测八种常见癌症，包括结直肠癌；使用对总共16种不同癌症基因中的多个突变的分析结合选定的蛋白质生物标志物，作者在43%的I期结直肠癌患者中检测到ctDNA，而在II-III期检测率为70%，特异性为99%[22]。Osumi等通过下一代测序（NGS）对血浆中结直肠癌常见的14种突变基因进行分析，发现血浆中突变基因频率与肿瘤转移（肝脏，淋巴结，转移器官数），肿瘤标志物（CEA,CA19-9,LDH）和肿瘤直径（最大值）显着相关[23]。Ou等利用集成化综合液滴数字检测（Integratedcomprehensivedropletdigitaldetection,IC3D）数字PCR系统提出了一种新的液体活检方法，该系统可大大提升ctDNA检测灵敏度，比现有的商业液体活检ddPCR和qPCR平台高50-1000倍。目前，该团队正在进行一项临床研究评估IC3DctDNA检测对预测早期结直肠癌的微小残留病变和复发的预后的意义[24]。

ctDNA也可用于结直肠癌复发的监测，Scholer等对27名结直肠癌患者进行了纵向追踪，显示所有复发患者术后均检测到ctDNA(n=14），而非复发患者未检测到ctDNA。另外利用ctDNA检测复发，与CT相比，平均提前9.4个月[25]。Symonds等检测了144名患者的ctDNABCAT1/IKZF1基因甲基化突变和CEA水平，显示甲基化ctDNA检测对复发的敏感性为66.0%(95%CI,57.1%-69.3%），显著高于CEA(31.9%;95%CI,22.8%-36.6%）；特异性无差异（ctDNA,97.9%;95%CI,93.2%-99.6%;CEA,96.4%;95%CI,91.4%-99.0%)[26]。Benesova等研究显示在22名复发患者中，22例ctDNA检测阳性（100%），而影像学检测到16例阳性（73%），肿瘤标志物升高15例（68%)[27]。Tie等检测了96例III期结肠癌患者的术后样本，发现20例中可检测到循环肿瘤DNA，并且与较低的无复发生存率相关（风险比，3.8;95%CI,2.4-21.0)[28]。Tarazona等同样报道了在接受辅助化疗的结直肠癌患者中，治疗后检测到ctDNA与复发相关（HR10.02)[29]。

3、总结与展望

ctDNA检测具有非侵入、特异性高、敏感性高、以及能够全面反映肿瘤异质性等优点，在结直肠癌早期诊断中应用前景广泛。在预测化疗疗效和临床预后[30]，全面准确提供患者体内不同肿瘤的信息[31]，检测肿瘤耐药性[32]等方面亦具有使用价值。但ctDNA检测仍存在成本高、技术复杂、不同方法的结果尚无固定标准、可靠性与稳定性无法确定，且ctDNA产生机制尚不清楚等问题[33,34]。因此2018年美国临床肿瘤学会和美国病理学家学会的一篇联合评论认为没有临床实用性的证据表明ctDNA检测在早期癌症，治疗监测或残留疾病检测中的临床有效性。除临床试验之外，没有临床有效性或临床效用的证据表明ctDNA测定可用于癌症筛查[35]。ctDNA在结直肠癌诊断的应用仍需要进一步研究。

参考文献：

[3]张卫刚,张言言,张宪文,等.不同分期结直肠癌患者的预后分析:一项基于SEER数据库的回顾性研究[J].中华结直肠疾病电子杂志,2017,6(01):21-27.

于恒响,周黎明.ctDNA在结直肠癌诊断中的应用进展[J].四川生理科学杂志,2020,42(03):362-365+309.