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TRAP1对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响

2020-09-27 290 上传者：管理员

摘要：目的探讨肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(TRAP1)在结直肠癌中的表达情况及对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响。方法通过Oncomine数据库分析TRAP1在结直肠癌组织和正常肠黏膜组织中的表达，Westernblot检测TRAP1在结直肠癌组织及其配对癌旁黏膜组织、LOVO、HT29、HCT116、RKO、SW480、NCM460细胞中的表达及干扰TRAP1对细胞周期相关蛋白、凋亡相关蛋白及PI3K/AKT通路的影响，CCK-8检测TRAP1对结直肠癌细胞增殖的影响，平板克隆实验检测TRAP1对结直肠癌细胞克隆形成能力的影响，流式细胞术检测TRAP1对细胞周期及凋亡的影响。结果生物信息学分析显示TRAP1在结直肠癌中的表达高于正常肠黏膜组织，Westernblot结果显示TRAP1在结直肠癌组织和细胞中蛋白表达水平均高于正常组织和细胞(P<0.05)，干扰TRAP1的表达可以显著抑制SW480细胞的增殖及克隆形成能力(P<0.05)，并且将细胞阻滞在G0/G1期，增加细胞凋亡(P<0.01)，细胞周期相关蛋白CyclinD1表达降低，凋亡相关蛋白Cleaved-Casp3表达增加，p-PI3K和p-AKT表达降低(P<0.05)。结论TRAP1在结直肠癌中高表达，干扰TRAP1的表达可以通过抑制PI3K/AKT通路的激活，从而降低结直肠癌细胞的增殖能力，促进细胞凋亡。

关键词：
RNA干扰
细胞凋亡
细胞增殖
细胞系
结直肠肿瘤
肿瘤
肿瘤坏死因子受体相关蛋白1
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结直肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率和死亡率均位居恶性肿瘤第5位[1]。肿瘤细胞增殖和凋亡抵抗是导致不良预后的原因之一，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶信号通路是经典的肿瘤相关信号通路，对CRC细胞增殖和凋亡发挥重要的调节作用[2]。因此，针对PI3K/AKT信号通路关键节点以及调控因子进行研究有望为改善CRC患者预后提供新的突破点。肿瘤坏死因子受体相关蛋白1是近年来研究发现的肿瘤相关蛋白，在多种肿瘤中异常表达[3]，广泛参与调节肿瘤细胞周期、增殖、凋亡、迁移、上皮间质转化等多种生物学行为。目前TRAP1蛋白与CRC关系的研究已初见报道[4,5]，但其相关生物学功能仍不清楚。本研究旨在探讨TRAP1在CRC中的表达和对CRC细胞增殖、凋亡的影响，及其对PI3K/AKT信号通路的调节作用，为针对TRAP1蛋白设计抗癌药物提供理论和实验依据。

1、材料与方法

1.1主要材料

（1）标本：选取2018年在南方医科大学南方医院进行手术治疗的6例CRC患者的癌及癌旁配对黏膜组织，所有患者手术前均未接受过放化疗或靶向治疗。所有标本在离体后均经预冷的PBS洗涤干净，液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。（2）细胞及主要试剂：人结直肠癌细胞株LOVO、HT29、HCT116、RKO、SW480及正常结肠永生化上皮细胞NCM460均由南方医科大学病理实验室提供。胎牛血清和RPMI-1640购自美国GIBCO公司，TRAP1（兔多抗）、GAPDH（鼠单抗）、CyclinD1（兔多抗）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗购于Proteintech公司，Cleaved-casp3（兔多抗）、casp3（兔多抗）购自Affinity公司，p-PI3K（兔单抗）、PI3K（兔单抗）、pAKT（兔多抗）、AKT（兔多抗）抗体购自CellSignalingTechnology公司；LipofectamineTM3000购自LifeTechnologies,CCK8试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，细胞周期及AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2方法

1.2.1通过Oncomine数据库分析TRAP1表达Oncominehttps://www.oncomine.org/

打开Oncomine数据库，选择分析类型为Cancervs.NormalAnalysis，肿瘤类别（CancerType）选择ColorectalCancer进行分析，设置P<0.05为有统计学意义。

1.2.2细胞转染

取对数生长期的SW480细胞，以1×106个/30%～50%Lipo-孔接种于6孔板中，待细胞密度为30%～50%时采用Lipo-fectamine3000分别转染对照序列NC和TRAP1的干扰序列，操作严格按照Lipofectamine3000转染试剂盒说明书进行。TRAP1干扰序列购自苏州吉玛公司，si-1引物：上游5´-CG-GUCCCUGUACUCAGAAATT-3´，下游5´-UUUCUGAGUA-CAGGGACCGGG-3´；si-2引物：上游5´-GCUACACCCUGCA-CUAUAATT-3´，下游5´-UUAUAGUGCAGGGUGUAGCGG-3´；si-3引物：上游5´-CCTTCCTGGATGCTCTGCATT-3´，下游5´-TGCAGAGCATCCAGGAAGGCC-3´。

1.2.3Westernblot检测TRAP1蛋白对细胞周期相关蛋白、凋亡相关蛋白及PI3K/AKT通路的影响

提取组织和细胞全蛋白，定量后用10%SDS-PAGE凝胶对蛋白进行电泳分离，湿法转印至PVDF膜上，将膜放入5%牛奶，配摇床缓慢摇动封闭1h，加入稀释后的一抗TRAP1(1∶1000）、CyclinD1(1∶1000）、Cleaved-Casp3(1∶1000）、Casp3(1∶1000）、p-PI3K(1∶1000）、PI3K(1∶1000）、p-AKT(1∶1000）、AKT(1∶1000）、GAPDH(1∶1000)4℃孵育过夜，次日PBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶10000），配摇床室温孵育1h,PBST洗膜3次后ECL化学发光显色，并应用ImageJ软件分析目标蛋白和内参蛋白灰度值，相对表达量=目标灰度值/内参灰度值。

1.2.4CCK-8法检测TRAP1对CRC细胞增殖的影响

将TRAP1的干扰片段及对照片段瞬时转染入SW480细胞，24h后消化并计数，以1000个/孔的密度接种于96孔板，分别于24、48、72、96、120h将孔内培养基更换为含10%CCK-8试剂的培养基，37℃、5%CO2条件下孵育2h，全自动酶标仪490nm处测定光密度（OD）值，并绘制细胞增殖曲线。每组细胞设置5个平行复孔，实验重复3次。

1.2.5平板克隆实验检测TRAP1对CRC细胞克隆形成能力的影响

将干扰TRAP1的SW480细胞及对照细胞计数后以200个/孔种植于6孔板中，37℃、5%CO2条件下培养2周，甲醇固定15min,PBS洗3次，吉姆萨染色15min，水洗后拍照计数克隆数目。

1.2.6流式细胞术检测TRAP1对CRC细胞周期的影响

将干扰TRAP1的SW480细胞及对照细胞消化后离心弃上清，预冷的PBS洗涤2次，预冷的75%乙醇固定1h，离心弃上清加入25µLPI染色液和10µLRNaseA,4℃避光反应30min，利用流式细胞仪对各组细胞进行检测。

1.2.7流式细胞术检测TRAP1对CRC细胞凋亡的影响

将干扰TRAP1的SW480细胞及对照细胞用不含EDTA的胰酶消化后1000r/min离心5min,PBS洗涤3次。随后用100µL的BindingBuffer重悬细胞，并加入5µLAnnexinV-APC及5µLPI染色液，混匀室温避光反应15min，再加入400µL的BindingBuffer混匀后上机检测。

1.3统计学方法

采用SPSS20.0软件进行数据处理，所有实验均独立重复3次，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两样本均数比较采用t检验，多组间的均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Dunnett-t检验。CCK8结果采用析因分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1TRAP1在CRC组织和细胞中的表达

通过Oncomine数据库分析，在Notterman数据库中，正常结直肠组织TRAP1比结直肠癌组织中升高（n=18,Fold=3.408,P<0.01）。Skrzypczak数据库中分析发现TRAP1在结直肠癌组织中的表达比正常肠黏膜组织高（n正常=24,n肿瘤=45,Fold=2.014,P<0.01）。Westernblot显示，6对CRC组织中TRAP1的表达明显高于癌旁配对正常肠黏膜组织，见表1、图1A。在结直肠癌细胞LOVO、HT29、HCT116、RKO、SW480中TRAP1的表达水平（分别为0.81±0.02、1.21±0.04、1.55±0.04、1.89±0.04、2.00±0.03）也明显高于正常永生化结肠上皮细胞NCM460(0.45±0.02），差异有统计学意义（n=3,F=85.297,P<0.01），见图1B。

表1TRAP1在CRC组织及癌旁正常组织中的表达（n=3,±s)

**P<0.01

图1TRAP1在结直肠癌组织和细胞中的表达

2.2TRAP1对CRC细胞增殖的影响

Westernblot结果显示，TRAP1的干扰序列均有效，NC、si-1、si-2、si-3组干扰效率分别为1.40±0.03、0.21±0.02、0.36±0.03、0.39±0.03，选取干扰效率最高的si-1组进行后续研究（n=3,F=1010.014,P<0.05），见图2。平板克隆实验显示，干扰TRAP1的表达（NC、si-1组分别为81.00±3.61、25.67±2.08）可以明显降低SW480细胞的克隆形成能力（n=3,t=23.020,P<0.05），见图3A。CCK8结果显示干扰TRAP1的表达可以显著降低SW480细胞的增殖能力（n=3,F组间=160.630,F时间=775.226,F交互=16.355,P<0.05），见图3B。

图2TRAP1干扰效率的检测

图3TRAP1对CRC细胞增殖能力的影响

A：干扰TRAP1对CRC细胞克隆能力的影响；B：干扰TRAP1对CRC细胞增殖能力的影响Fig.3TheeffectofTRAP1ontheproliferationofCRCcells

2.3TRAP1对CRC细胞周期和凋亡的影响

流式细胞检测结果显示，干扰TRAP1的表达后可以将SW480细胞周期阻滞在G0/G1期（P<0.01），见表2，图4A，并且增加细胞凋亡（NC组、si-1组细胞凋亡率分别为5.80%±0.70%、9.73%±0.68%;n=3,t=6.977,P<0.01），见图4B。

表2TRAP1对CRC细胞周期的影响（%，±s)

*P<0.05,**P<0.01

2.4TRAP1对增殖、凋亡相关指标及PI3K/AKT通路的影响

Westernblot结果显示，干扰TRAP1的表达后，细胞周期相关蛋白CyclinD1表达降低（P<0.01），见图5A，表3；凋亡相关蛋白Cleaved-Casp3表达增加（P<0.05），见图5B，表3;p-PI3K和p-AKT表达降低（P<0.01),PI3K/AKT通路被抑制，见表4，图6。

3、讨论

CRC治疗是全世界面临的难题，前期笔者团队针对CRC开展了相关基础研究，发现转化生长因子β是诱导CRCEMT和转移的重要因子，而二苯乙烯苷可通过抑制PI3K/AKT通路，拮抗TGFβ介导的肿瘤转移效应，因此二苯乙烯苷有望通过抑制PI3K/AKT通路应用于CRC治疗[6]。除了肿瘤转移，肿瘤细胞的恶性增殖和凋亡抵抗也是介导CRC患者不良预后的重要原因。因此探索肿瘤增殖和凋亡相关基因，有望为治疗CRC提供新的方法。

图4TRAP1对CRC细胞周期和凋亡的影响

A：干扰TRAP1对细胞周期的影响；B：干扰TRAP1对细胞凋亡的影响图5TRAP1对CyclinD1和Cleaved-caspase3蛋白表达的影响

表3TRAP1对CyclinD1和Cleaved-caspase3蛋白表达的影响

*P<0.05,**P<0.01

为了进一步寻找CRC肿瘤相关基因，本研究通过生物信息学分析成功筛选出TRAP1是CRC潜在的癌基因。回顾既往研究，TRAP1在多种肿瘤中高表达。Ou等[7]发现TRAP1在食管癌中表达升高，与患者淋巴结转移密切相关，并可通过激活STAT3/MMP2信号通路，促进食管癌细胞的迁移和侵袭。在甲状腺癌中，TRAP1的表达随着恶性程度增加而增加，通过调控ERK信号通路促进甲状腺癌细胞的增殖、抑制凋亡[8]。值得注意的是，TRAP1除了扮演促癌基因角色外，也在部分肿瘤中低表达，从而发挥抑癌作用。Yin等[9]研究证实TRAP1在胶质母细胞瘤中表达降低，并调控肿瘤细胞侵袭与凋亡。目前TRAP1在CRC中的作用已初见报道，Pak等[10]研究发现过表达TRAP1可能导致CRC细胞的局部侵袭，其表达与CRC侵袭深度和不良预后相关。Han等[11]通过免疫组化检测结直肠癌手术标本中的TRAP1和切除修复交叉互补基因1(ERCC1）的表达，发现TRAP1与ERCC1表达的高低可预测CRC对奥沙利铂和5-氟尿嘧啶（5-Fu）的化疗敏感性。但目前TRAP1在CRC中作用的研究大部分处于基因表达水平，缺乏基础实验依据，其在CRC中的表达和生物学功能仍需进一步挖掘。

表4SW480细胞中TRAP1对PI3K/AKT信号通路的影响

**P<0.01

图6TRAP1对PI3K/AKT信号通路的影响

本研究多层次检测了TRAP1的表达，发现TRAP1在CRC组织中的蛋白表达水平显著升高，同样，与NCM460细胞相比，TRAP1在CRC细胞中的表达也更高。文献报道TRAP1可调控肿瘤细胞增殖和凋亡进程[12,13]。本研究也针对该生物学行为进行观察，在SW480细胞中干扰TRAP1后，肿瘤细胞的增殖能力和克隆形成能力明显减弱；流式细胞术检测发现干扰TRAP1后SW480细胞周期阻滞在G0/G1期，并且凋亡增加；同时，细胞周期相关蛋白CyclinD1表达降低，而凋亡相关蛋白Cleaved-Casp3表达增加，说明TRAP1可以促进CRC细胞增殖、抑制CRC细胞凋亡，是CRC的癌基因。

肿瘤细胞信号传导与肿瘤细胞恶性生物学行为密切相关[14]，其中，PI3K/AKT信号通路是与肿瘤增殖和凋亡最相关的信号通路之一[15]。笔者前期针对PI3K/AKT的通路及其潜在抑制药物已经开展了相关基础研究[6]，另有研究也证实TRAP1抑制剂SNX-2112可抑制AKT通路及其下游核因子（NF）-κB的活性[16]。本研究通过Westernblot证实，干扰TRAP1后，CRC细胞PI3K和AKT磷酸化水平显著降低，进而支持TRAP1可正向调控PI3K/AKT信号通路，因此推测其对CRC细胞增殖和凋亡的影响可能是通过PI3K/AKT信号轴来发挥的。

综上，本研究证实TRAP1是CRC的癌基因，在CRC中高表达，可促进CRC细胞增殖而抑制其凋亡，其潜在机制与TRAP1激活PI3K/AKT通路相关，为针对TRAP1设计PI3K/AKT通路抑制剂和抗肿瘤药物提供了实验证据。

参考文献：

[6]李品玉,刘其礼,王敏,等.二苯乙烯苷通过PI3K/AKT通路抑制TGFβ诱导的结直肠癌上皮间质转换[J].临床与病理杂志,2017,37(9):1803-1808.

李品玉,盛文杰,张嫄怡,杨坚,郑培丽,张菲菲.TRAP1对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响[J].天津医药,2020,48(09):813-817.

基金:广东省普通高校青年创新人才类项目(2018GkQNCX120).