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lncRNA FAM83H-AS1对结直肠癌细胞增殖和侵袭迁移的影响

2023-11-27 64 上传者：管理员

摘要：目的探讨长链非编码RNA序列相似性家族83成员H反义RNA 1(lncRNA FAM83H-AS1)在结直肠癌组织和细胞中的表达水平及其对结直肠癌细胞增殖和侵袭迁移的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测lncRNA FAM83H-AS1在结直肠癌组织、细胞和血浆中的表达水平，并分析lncRNA FAM83H-AS1表达水平与结直肠癌患者临床特征的关系。构建具有干扰lncRNA FAM83H-AS1表达水平的SW620细胞模型。采用CCK8法和Transwell法分别分析lncRNA FAM83H-AS1对细胞增殖、细胞迁移和侵袭能力的影响。采用qPCR和免疫印迹法检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的表达水平。结果与正常对照组相比，lncRNA FAM83H-AS1在结直肠癌组织和血浆中的表达显著上调(P<0.05),且在SW620的表达水平高于正常结肠黏膜细胞及其他结直肠癌细胞系，差异有统计学意义(P<0.05);lncRNA FAM83H-AS1的表达水平与远处转移(P=0.019)和TNM分期(P=0.044)有关，但与性别、年龄、肿瘤位置和浸润深度无关(P>0.05)。干扰lncRNA FAM83H-AS1表达水平对结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力有明显的抑制作用(P<0.05)。sh-FAM83H-AS1转染细胞中MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 lncRNA FAM83H-AS1表达水平增加可能与结直肠癌的发生发展有关，提示lncRNA FAM83H-AS1可能是结直肠癌诊断和治疗的潜在生物标志物。

关键词：
侵袭
消化道肿瘤
结直肠癌
迁移
长链非编码RNA序列相似性家族83成员H反义RNA 1
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结直肠癌(CRC)是一种常见的消化道肿瘤，在世界上大多数国家的发病率和死亡率显著增加[1]。目前认为CRC的发生是一个多因素、多阶段、多基因改变的协同过程，癌基因和抑癌基因的表达水平失调是CRC发生的分子基础[2]。长链非编码RNA(lncRNA)可以参与许多生物反应，主要在基因表达水平上发挥对原癌基因或抑癌基因的表观遗传、转录以及转录后调控的作用，进而参与多种肿瘤和其他疾病的发生和发展[3]。有研究表明，lncRNA与肿瘤细胞的增殖、转移及预后密切相关。lncRNA TBILA可通过转化生长因子β1(TGFB1)调节和加速肺癌细胞的增殖[4]。肌动蛋白丝相关蛋1-反义RNA1(AFAP1-AS1)是一种在CRC组织中表达水平显著升高的lncRNA,通过调节EZH2增强子的表达水平来增加细胞的增殖和侵袭[5]。同时，lncRNA已被报道作为一种新的诊断或诊断预后的生物标志物。本课题组在前期应用转录组测序技术对CRC组织和癌旁组织进行测序分析，筛选出了表达水平具有明显差异的长链非编码RNA序列相似性家族83成员H反义RNA 1(lncRNA FAM83H-AS1)。早期的研究发现lncRNA FAM83H-AS1在胶质瘤肿瘤组织中呈高表达水平[6]。在肺腺癌中，lncRNA FAM83H-AS1呈高表达水平的患者提示生存率较差，而下调该基因可通过调控MET/EGFR信号通路减弱细胞增殖和侵袭作用[7]。之前的RNA测序研究显示，lncRNA FAM83H-AS1在CRC组织中表达水平上调[8],然而目前关于lncRNA FAM83H-AS1在CRC中的功能和作用机制报道较少。本研究旨在分析lncRNA FAM83H-AS1在CRC组织、细胞和血浆中的表达水平情况，并探究其表达水平敲低对CRC细胞增殖和侵袭迁移作用的影响及其潜在的分子机制，以期为CRC的分子诊疗提供新的依据。

1、资料与方法

1.1 一般资料

回顾性选取2017年5月至2019年12月于福建省立医院(下称本院)胃肠外科和肿瘤外科接受CRC手术切除的53例CRC患者的肿瘤组织，以及距癌灶5 cm以上的正常黏膜，放入液氮保存。所有标本均经病理检查证实，所有入选患者术前均未接受放化疗治疗。另收集2020年8月至2022年2月本院88例CRC患者和32例体检健康者的血浆样本。每位受试者收集5 mL抗凝血液，3 000 r/min分离血浆5 min, -80 ℃保存至使用。本研究经医院伦理审查委员会批准，入选患者均知情同意。

1.2 仪器与试剂

FHC(正常结肠黏膜细胞系)和Caco-2(CRC细胞系)购自美国ATCC。SW480(CRC细胞系)购自中国科学院上海细胞生物学研究所。SW620、HCT116、LoVo和HT29(CRC细胞系)来源于本实验室。DMEM培养基、胰酶、胎牛血清购自Gibco公司，Transwell小室购自美国Corning公司，CCK8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，L-15培养基购自南京凯基生物公司，SYBR Green PCR Mix试剂盒购自日本TaKaRa公司，抗基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9抗体购自美国Santa Cruz公司。Trizol试剂、抗GAPDH和二抗购自北京康为生物技术公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

SW480和SW620接种于L-15培养基，其他细胞系接种于DMEM培养基；培养液均含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和链霉素，在细胞培养箱于5%CO2、37 ℃条件下培养，待细胞融合度达约90%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。

1.3.2 细胞转染

按照1×105个/孔的密度将细胞接种于6孔板内，待细胞达约80%汇合时，按照转染操作说明书将3个靶shRNA和阴性对照(上海吉玛公司)转染入细胞，最终浓度为10 nmol/L。12 h后吸弃病毒培养液，加入新鲜培养基继续培养。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)分析方法检测干扰效率。

1.3.3 qPCR检测

使用Trizol试剂提取总RNA,使用NanoDrop分光光度计检测 RNA 浓度和纯度。取1 μg RNA按照逆转录试剂盒逆转录成cDNA。然后，根据说明书进行qPCR反应，采用2×SYBR Green PCR Mix进行。总反应体系25 μL,反应条件：95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s, 60 ℃退火、延伸30 s, 共45个循环。以甘油醛-3磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，采用2-ΔΔCt公式计算表达水平。引物序列如下，lncRNA FAM83H-AS1正向为5′-TAG GAA ACG AGC GAG CCC-3′;反向为5′-GCT TTG GGT CTC CCC TTC TT-3′;GAPDH正向为5′-ATG GAA ATC CCA TCA CCA TCT T-3′;反向为5′-ACG TAC TCA GCG CCA GCA T-3′;MMP-2正向为5′-CCA TCA TCA AGT TCC CCG GC-3′;反向为5′-CTG GGG CAG TCC AAA GAA CT-3′;MMP-9正向为5′-ACG ATG ACG AGT TGT GGT CC-3′;反向为5′-AGA AGC CGA AGA GCT TGT CC-3′。

1.3.4 细胞增殖试验

转染后，收集每组的对数期细胞，在96孔板的5 000个细胞/孔中接种，然后在5%CO2和37 ℃条件下培养。在细胞接种后的24、48、72 h, 向每孔加入10 μL的CCK-8试剂，细胞在37 ℃下再孵育2 h。用酶标仪以630 nm为参考波长，以450 nm波长测定各孔内吸光度(A)值。

1.3.5 细胞迁移和侵袭实验

迁移实验：将转染后的细胞消化后重悬于无血清培养液，调整细胞密度为5×105个/毫升，在Transwell上层小室中按每孔100 μL加入无血清细胞悬液(5×104个细胞),下室加入600 μL 含10%胎牛血清的新鲜培养基，于5% CO2、37 ℃培养箱中继续培养24 h。取出小室，用棉签擦去上室内的细胞，经4%多聚甲醛固定和结晶紫染液染色后，用显微镜观察和拍照，随机选取8个视野进行计数。侵袭实验：需在 Transwell小室上室预先包被Matrigel基质胶后备用，其余步骤同迁移实验。

1.3.6 免疫印迹法

收集各组细胞裂解后提取蛋白，BCA法定量。取15 μg蛋白样品经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，使用5%脱脂奶粉封闭2 h, 加一抗孵育过夜。TBST洗膜3次后分别与HRP标记的羊抗兔二抗孵育1 h, 增强型化学发光试剂(ECL)显影并拍照。以GAPDH为内参，用Image J软件对蛋白条带进行灰度分析。

1.4 统计学处理

采用SPSS21.0统计学软件进行数据分析。呈正态分布的计量资料以x¯±s

表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(两两比较采用SNK法)。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1lncRNA FAM83H-AS1在CRC患者中的表达水平

lncRNA FAM83H-AS1在CRC组织中的表达水平显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05),在CRC细胞株中的表达水平也显著高于正常结肠黏膜细胞FHC,差异有统计学意义(P<0.05)。lncRNA FAM83H-AS1在CRC患者血浆中的表达水平明显高于健康者血浆，差异有统计学意义(P<0.05)。lncRNA FAM83H-AS1对CRC患者的AUC为0.751,灵敏度为76%,特异度为66%。见图1。

2.2lncRNA FAM83H-AS1的表达水平与CRC临床病理特征的关系

lncRNA FAM83H-AS1表达水平升高与肿瘤的远处转移(P=0.019)和TNM分期(P=0.044)有关，但与患者的性别、年龄、肿瘤部位、浸润深度等均无相关性(P>0.05)。见表1。

图1 lncRNA FAM83H-AS1在CRC样本中的表达情况

表1 lncRNA FAM83H-AS1表达水平与临床病理特征的关系(n)

2.3 敲低lncRNA FAM83H-AS1的表达水平对SW620细胞增殖的影响

将sh-FAM83H-AS1慢病毒转染入表达水平最高的SW620细胞后，荧光显微镜下观察各组转染效率均为80%以上。qPCR检测结果显示，sh-FAM83H-AS1转染组FAM83H-AS1的表达水平明显低于转染阳性对照(NC)组，差异有统计学意义(P<0.05),且在3个sh-FAM83H-AS1转染组中sh-FAM83H-AS1-1表现出最高的干扰效率。CCK8检测结果显示，与NC组相比，sh-FAM83H-AS1转染组的细胞增殖被明显抑制(P<0.05),说明FAM83H-AS1可促进CRC细胞增殖。见图2。

2.4 敲低lncRNA FAM83H-AS1的表达水平对SW620细胞迁移和侵袭的影响

Transwell实验结果显示，与NC组相比，sh-FAM83H-AS1转染组平均每个视野穿至小室外的迁移细胞数和侵袭细胞数均明显减少，差异有统计学意义(P<0.05),细胞迁移和侵袭能力明显受到抑制，说明FAM83H-AS1可促进CRC细胞迁移和侵袭。见图3。

2.5 敲低lncRNA FAM83H-AS1的表达水平对MMP-2、MMP-9表达水平的影响

qPCR和免疫印迹法结果显示，与NC组相比，sh-FAM83H-AS1转染组MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白表达水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图2 敲低lncRNA FAM83H-AS1表达水平对CRC细胞增殖的影响

图3 Transwell实验检测lncRNA FAM83H-AS1对SW620细胞迁移和侵袭能力的影响

图4 敲低lncRNA FAM83H-AS1对MMP-2、MMP-9表达水平的影响

3、讨论

CRC是我国常见的胃肠道恶性肿瘤，是癌症相关死亡的第八大原因[8]。然而，癌症诊断技术和治疗方面的巨大进步并不能显著延长CRC患者的总生存时间[9],其最重要的原因是临床确诊CRC缺乏足够的生物标志物，从而使患者无法得到有效地治疗。因此，寻找新的CRC分子诊断和治疗靶点，分析肿瘤进展的相关机制，对CRC预后改善和生存率的提高具有重要意义。

lncRNA是RNA 聚合酶转录过程中产生的、由200多个核苷酸组成一组RNA,它是一种具有编码蛋白潜能的基因，在肿瘤生物学中扮演着举足轻重的角色[10]。肿瘤患者中lncRNA的异常在肿瘤发生中起着重要作用，目前越来越多的研究表明，多种异常表达的 lncRNAs 与包括CRC在内的多种恶性肿瘤有关[11,12,13],其功能也包括了调节癌细胞增殖和转移[14,15]。MA等[16]研究表明，lncRNA FAM83H-AS1的上调通过Wnt/β-连环蛋白通路促进肝细胞癌的细胞增殖、迁移和侵袭。lncRNA FAM83H-AS1也通过表观遗传学沉默CDKN1A(p21)在胶质瘤中发挥致癌作用[6]。

在本研究中，本文首先检测了lncRNA FAM83H-AS1在CRC组织和细胞系中的表达水平。结果显示，lncRNA FAM83H-AS1在CRC组织中的表达水平明显高于邻近的癌旁组织，且在CRC细胞系中的表达水平也高于正常结肠黏膜细胞。此外，本文还检测了lncRNA FAM83H-AS1在CRC患者血浆和健康者血浆中的表达水平，发现其在CRC患者血浆中的表达水平明显高于健康者血浆。本文分析了lncRNA FAM83H-AS1的表达水平与临床病理特征的关系，结果显示lncRNA FAM83H-AS1的高表达与CRC患者的远处转移及TNM分期显著相关。由此可以推断出lncRNA FAM83H-AS1有望成为CRC的早期筛查、早期诊断和预后判断的潜在分子标志。继而，本文以lncRNA FAM83H-AS1表达水平相对较高的 SW620细胞为研究对象，探讨lncRNA FAM83H-AS1对于CRC 细胞侵袭迁移能力的影响。本研究将sh-FAM83H-AS1慢病毒转染入SW620细胞，敲低其表达水平，结果显示转染后细胞增殖受到明显抑制；同时，Transwell实验证实敲低lncRNA FAM83H-AS1可显著抑制SW620细胞的迁移和侵袭能力，提示在CRC细胞中lncRNA FAM83H-AS1起促癌的作用。

肿瘤的转移被认为是CRC患者的重要死因之一，抑制肿瘤的侵袭和迁移可有效遏制肿瘤的进展。细胞外基质和基底一起构成肿瘤转移过程中的第一道屏障，其降解是肿瘤侵袭和转移的关键环节。MMPs是一类锌离子和钙离子依赖的蛋白酶家族，参与调控肿瘤细胞的侵袭迁移过程。肿瘤细胞通过合成和分泌 MMPs降解细胞外基质的各种蛋白质底物，包括胶原蛋白和弹性蛋白，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，从而促进肿瘤的侵袭和转移[17],并在血管生成、细胞凋亡和组织修复中发挥作用。多项研究证实，MMP-2和MMP-9激活后的异常高表达与肿瘤转移的多样性和预后不良密切相关[18,19]。本研究在证实了lncRNA FAM83H-AS1参与对CRC细胞侵袭迁移能力的调控后，进一步发现其可能通过上调MMP-2和MMP-9的表达水平，加速细胞外基质的降解，从而促进CRC细胞的侵袭迁移过程。

综上所述，lncRNA FAM83H-AS1在CRC组织和细胞中呈高表达且发挥促癌作用，通过外源 shRNA手段下调其表达可抑制其增殖和迁移侵袭能力，可能与抑制MMP-2和MMP-9表达水平有关，有望成为CRC分子诊断和治疗的生物标志物和潜在靶点。

基金资助:福建省卫生健康委员会科技计划项目(2018-1-7);

文章来源:张彪,朱庆芳.lncRNA FAM83H-AS1对结直肠癌细胞增殖和侵袭迁移的影响[J].国际检验医学杂志,2023,44(22):2710-2715.