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SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂性能验证

2023-12-13 124 上传者：管理员

摘要：目的通过实验对黏结蛋白聚糖2(SDC2)和组织因子途径抑制剂2(TFPI2)基因甲基化联合检测试剂盒(荧光PCR法)进行性能验证，为临床实验室应用该试剂进行结直肠癌早筛提供参考。方法参考相关指南要求，通过选择符合实验条件的临床标本和参考品，通过方法符合率、检出限、精密度和抗干扰能力对试剂盒的性能进行多方面的评价。结果该试剂盒检测结果与肠镜检查和(或)病理诊断结果相比的符合率为96.7%;最低检出限为10 000 copy/mL;批内、批间循环阈值变异系数≤5%;干扰物质新鲜乙二胺四乙酸抗凝血/甘油对试剂盒检测结果无影响，抗干扰能力合格。结论 SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒(荧光PCR法)性能评估合格，可用于临床标本的检测。

关键词：
性能验证
甲基化
组织因子途径抑制剂2
结直肠癌
黏结蛋白聚糖2
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结直肠癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率呈逐年递增的趋势[1,2]。结直肠癌的早诊筛查可以有效地降低结直肠癌的发病率和死亡率[3]。目前结直肠癌早期筛查技术主要包括结肠镜检查、粪便免疫化学测试(FIT)和多靶点粪便DNA检测等，其中结肠镜检查是结直肠癌筛查的金标准，但由于检查具有侵入性且需要充分的肠道准备，从而限制了该方法的普遍应用。其他无创筛查方法如多靶点粪便DNA检测对结直肠癌及进展期腺瘤的灵敏度均高于FIT,在临床上显示出较好的应用潜力[4,5]。研究发现黏结蛋白聚糖2(SDC2)和组织因子途径抑制剂2(TFPI2)基因在结直肠癌组织中呈现出高度甲基化，将SDC2和TFPI2基因甲基化水平作为结直肠癌的生物标志物，基于SDC2和TFPI2基因的粪便DNA检测可以更灵敏、特异的检测出结直肠癌[6,7]。

根据中国合格评定国家认可委员会(CNAS)《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明：CNAS-CL02-A009》[8]文件的相关要求，临床医学检验实验室在开展新的分子检测项目时必须对检测系统进行性能验证，以保证分子检测项目检测流程的可靠性及检测结果的准确性。本研究参照CNAS发布并实施的《分子诊断检验程序性能验证指南：CNAS-GL039》[9]对SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒(荧光PCR法)分别进行方法符合率、检出限、精密度和抗干扰能力的性能验证，以期为各检验实验室在开展新的分子检测项目制订性能验证方案时提供一定的理论参考。

1、材料与方法

1.1标本来源

选取武汉市东西湖区人民医院的30例粪便标本(结直肠癌标本25例和非结直肠癌标本5例),3份含1%甲基化目的基因的检测限参考品(核酸浓度为10 000 copy/mL)来自于武汉艾米森生命科技有限公司。

1.2仪器与试剂

SLAN-96P全自动荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司),SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒(荧光PCR法，武汉艾米森生命科技有限公司),核酸提取试剂和核酸纯化试剂(武汉艾米森生命科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1粪便标本DNA提取和纯化

根据DNA提取试剂盒说明书的步骤要求提取粪便标本的DNA,按照核酸纯化试剂盒说明书对提取的DNA进行纯化。

1.3.2荧光PCR扩增检测

按照SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒(荧光PCR法)说明书配置反应体系25μL,包括14μL反应液Ⅰ(buffer和dNTP),5.7μL PCR反应液Ⅱ(引物和探针),0.3μL热启动Taq酶，阴性对照NC、标本核酸转化液、阳性对照PC各5μL。加样后，确定盖好管盖或封膜后，短暂离心30 s(避免有气泡，如果有气泡，用手指轻弹，重新瞬时离心),立即进行PCR扩增反应。扩增条件为95℃5 min, 1个循环；95℃15 s, 60℃30 s, 45个循环，60℃时收集ROX、FAM和VIC信号。

1.3.3结果判读

按照SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒(荧光PCR法)说明书进行结果判读：甲基化的SDC2基因DNA片段(ROX信号通道)和TFPI2基因DNA片段(FAM信号通道)及内控基因ACTB(VIC信号通道)。ACTB基因即为β-actin,是常用管家基因，用于评估检测中标本DNA水平和质量，避免由于标本DNA水平和质量的问题导致假阴性结果。阳性对照ROX、FAM和VIC通道均应有扩增曲线升起，并且循环阈值(Ct值)在26～30;阴性对照ROX、FAM和VIC通道均应无扩增曲线升起或Ct值>40;待测标本在VIC通道有扩增曲线升起且Ct值≤36的条件下，如果ROX和(或)FAM通道有扩增曲线升起且Ct值≤38,则判断标本甲基化阳性，如果ROX和FAM通道均无扩增曲线升起或Ct值>38,则判断标本甲基化阴性。

1.3.4方法符合率

采用肠镜检查和(或)与病理诊断结果结合的金标准方法为对照方法，用候选方法检测30例粪便标本，其中包括结直肠癌标本25例和非结直肠癌标本5例。

1.3.5检出限

通过对3份含1%甲基化目的基因的检测限参考品L1、L2和L3使用本检测试剂重复检测3次。L1为含1%甲基化TFPI2基因的参考品，L2为同时含1%甲基化SDC2和1%甲基化TFPI2基因的参考品，L3为含1%甲基化SDC2基因的参考品。所有参考品均为用甲基化目的基因质粒与从组织细胞内提取的基因组核酸，按照一定比例混合，最终得到含1%甲基化目的基因参考品。

1.3.6精密度

取1份阳性参考品，分5批次，每天检测一批次，每批次重复检测5次，记录结果。最后计算批内和批间Ct值的变异系数(CV),CV≤5%为合格。

1.3.7抗干扰能力

选取2例阳性粪便标本和1例阴性粪便标本，按照试剂厂商提供的每1 mL粪便标本加入6μL的比例最高抗干扰水平，分别加入干扰物质新鲜乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血/甘油，每例标本重复检测3次。

2、结果

2.1方法符合率验证结果

收集的30例标本中，阳性标本与肠镜检查和(或)病理诊断结果符合率为96.0%,阴性标本符合率为100.0%,总符合率为96.7%,验证通过。见表1。

表1方法符合率结果比对(n)

2.2检出限验证结果

含1%甲基化目的基因浓度为10 000 copy/mL的检测限参考品L1的TFPI2 3次重复检测Ct值均≤38;参考品L2的SDC2和TFPI2 3次重复检测Ct值均≤38;参考品L3的SDC2 3次重复检测Ct值均≤38,3个检测限参考品均为阳性，验证通过。见图1。

2.3精密度验证结果

1份阳性精密度参考品检测的批内、批间精密度CV均≤5%,验证通过。见表2、3。

图1各检测限参考品扩增动力学曲线

表2批内精密度验证结果(Ct值)

2.4抗干扰能力验证结果

通过对3例加入干扰物质的有效粪便标本(其中2例阳性，1例阴性),重复检测3次，干扰物质对测定无明显影响，验证通过。见图2。

图2各标本干扰实验扩增动力学曲线

表3批间精密度验证结果(Ct值)

3、讨论

研究表明成人每天都会有大量的肠上皮细胞从肠壁脱落，并通过大肠蠕动随粪便排出体外，而肿瘤细胞由于增生异常更容易从肠道脱落，因此结直肠癌患者的粪便中往往有大量的病变细胞及异常的细胞组分，这是多靶点粪便DNA检测稳定的物质基础[10]。基因的甲基化修饰是肿瘤发生的早期事件，从结直肠癌患者排遗物中获得的遗传物质可以更早地反映肠道是否存在癌变情况[11]。SDC2是一种细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，参与调节许多生理过程和病理过程，生理过程包括细胞增殖、分化、黏附、迁移、伤口愈合、血管生成；病理过程包括炎症和癌症[6]。TFPI2是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，已被鉴定为一种肿瘤抑制基因。TFPI2在调节细胞增殖、凋亡及血管生成等方面也发挥重要作用，TFPI2在维持肿瘤微环境的稳定性，抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移中均发挥重要作用[7]。SDC2和TFPI2基因在结直肠癌组织中呈现出高度甲基化，将SDC2和TFPI2基因甲基化状态作为结直肠癌的生物标志物，可以更灵敏、特异地检测出结直肠癌。

本检测试剂基于实时荧光定量PCR技术实现对粪便标本中SDC2和TFPI2基因甲基化的检测，在SDC2和TFPI2基因启动子与结直肠癌发生高度相关的CpG区域，针对经过重亚硫酸盐转化后的序列分别设计了特异性引物和特异性荧光探针，可以在PCR中专一地检测出甲基化的序列。从人粪便标本中获得肠道脱落细胞基因组DNA,然后用重亚硫酸盐进行转化，并通过三重PCR扩增来测定亚硫酸盐转化后的DNA,从而检测发生甲基化的SDC2基因DNA片段和TFPI2基因DNA片段，其中内控基因ACTB(β-Actin)为管家基因，用于评估检测中标本DNA水平和质量。

性能验证具体是指分子检测实验室按照检测系统或试剂盒说明书使用某种特定检测系统或试剂时，能够复现生产厂家声明的检测性能过程。性能验证不仅能够提高分子检测实验室对新的检测系统、新的检测试剂或新的检测方法相关性能指标的全面认识和理解，更重要的是对检测实验室技术质量管理水平的提升具有重要作用[12]。因此，在临床检测过程中，从保证检测质量的角度出发，任何一种用于分子检测实验室的新的检测系统、新的检测试剂或新的检测方法，在正式应用于临床检测前，均需要做性能验证[13,14,15]。本研究参照《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明：CNAS-CL02-A009》[8]对开展新的分子诊断项目需进行检测程序性能验证的要求，分别从方法符合率、检出限、精密度和抗干扰能力4个方面对SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒(荧光PCR法)进行性能验证评价。

在方法符合率验证中，参照《分子诊断检验程序性能验证指南：CNAS-GL039》[9]要求，选取阴性标本至少5例、阳性标本(宜包含弱阳性/低扩增的标本),一般不少于10例。在对试剂进行性能验证时，为排除和避免由于检测标本带来的误差，通常可以采用在指南要求的基础上进一步增加检测标本量的方法，进而提高和保证检测的准确性。为尽可能保证方法符合率验证的准确性，本研究选取30例粪便标本，包括经临床肠镜检查和(或)病理诊断确诊为结直肠癌的标本25例和非结直肠癌的标本5例。25例结直肠癌标本中有24例经本试剂检测为阳性，则阳性标本与肠镜检查和(或)病理诊断结果符合率为96.0%,高于临床试验确认的临床灵敏度(95.3%);5例非结直肠癌标本经本试剂检测全为阴性，阴性标本符合率为100.0%。以上检测结果表明，30例粪便标本通过本检测试剂的检测结果与对照方法(肠镜检查和(或)病理诊断)相比仅有1例标本不一致，即总符合率为96.7%(29/30)。

检出限又称为检测下限，是指能以适当的置信概率检出待测物质的最低浓度或最小质量。检出限既与检测器对待测物质的响应信号有关，又与空白值的波动程度有关。本研究选用试剂厂家提供的检出限参考品进行试剂盒检出限的验证，共选用3个浓度为10 000 copy/mL检出限参考品，每个参考品重复检测3次，依据检测试剂盒的判读标准所有检测结果均为明确阳性，符合试剂盒检出限的要求。

精密度通常是指对同一标本进行多次重复检测所得到的结果的一致程度，通常以CV表示。本研究选用试剂厂家提供的阳性参考品进行试剂盒精密度的验证，验证结果发现TFPI2、SDC2和ACTB的批内与批间检测结果Ct值的CV值均≤5%,符合试剂说明书要求标准，精密度验证合格。一般来说，检测方法或检测试剂的精密度高，可以更好地保障检测结果的稳定。

在临床检测过程中，为避免临床标本可能存在的内源性或外源性干扰物质对检测结果准确性的影响，造成假阴性结果的出现，通常建议选用抗干扰能力好的检测试剂。为确认及避免干扰物质对本试剂盒检测结果准确性的影响，本研究通过用本试剂盒检测分别加入新鲜EDTA抗凝血/甘油干扰物质的阳性标本和阴性标本，对本试剂盒进行抗干扰能力的验证，检测结果表明干扰物质未对检测结果造成影响，符合试剂说明书要求标准，说明本检测试剂抗干扰能力好。

综上所述，本实验针对方法符合率、检出限、精密度和抗干扰能力4个方面验证了SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒(荧光PCR法)的效果，所有实验结果均符合要求，表明本试剂可用于临床检测。

参考文献:

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[3]中国抗癌协会大肠癌专业委员会中国结直肠肿瘤早诊筛查策略制订专家组.中国结直肠肿瘤早诊筛查策略专家共识[J].中华胃肠外科杂志,2018,21(10):1081-1086.

[8]中国合格评定国家认可委员会.医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明:CNAS-CL02-A009[S].北京:中国标准出版社,2018.

[9]中国合格评定国家认可委员会.分子诊断检验程序性能验证指南:CNAS-GL039[S].北京:中国标准出版社,2019.

[14]杨鑫城,单幼兰.两种国产荧光定量PCR试剂与Roche定量试剂的比较[J].国际检验医学杂志,2023,44(1):29-33.

文章来源:李钦丽,张继伟.SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂性能验证[J].国际检验医学杂志,2023,44(23):2893-2896+2901.