结直肠癌是全球胃肠道常见的恶性肿瘤，2018年全球新增180万例，位列全球癌症排名第三名，是成人癌症相关死亡的第二大原因[1]。传统的结直肠癌治疗主要以手术、放化疗为主。近年来，随着分子靶向治疗及免疫检查点抑制剂的应用，使得结肠癌的治疗取得了较大的进步[2]。尽管如此，结直肠癌的发病和死亡率仍高居不下。虽然目前已经对结直肠癌发生和转移的机制进行了广泛的研究，但其发病的分子机制仍未完全阐明，因此寻找结直肠癌发病及进展相关新靶标对结直肠癌仍然具有非常重要的意义。在本研究中，通过使用公共数据我们发现MEX3A在结肠癌中的表达显著上调，而MEX3A在人类肿瘤尤其是结肠癌中的功能仍然未完全阐释清楚，因此本研究通过体外和体内实验探讨该基因在结肠癌中的功能，为结肠癌开发新的潜在治疗靶点提供新的理论依据。

1、材料与方法

1.1 临床样本

本研究临床样本经淮安市第一人民医院伦理委员会审批，纳入研究验证的临床样本为5例，均为2020年在本院行结肠癌手术治疗的患者，根据手术结果留取患者结肠癌组织及癌旁的正常组织，组织经处理后用于免疫组织化学染色检测。

1.2 公共数据库分析

对GEPIA数据库(http: //gepia.cancer-pku.cn/)中275例结肠癌组织样本和349例正常对照结肠组织样本中MEX3A表达进行分析，同时通过下载TCGA数据库中随访信息完整及临床病理和一般资料完善的结肠癌患者数据，分析MEX3A表达对患者总生存期及疾病相关存活率的影响。

1.3 材料与设备

本次研究的主要细胞HCT116、RKO细胞购自中国科学院上海细胞库。RPMI-1640培养基培养基(美国Gibco公司)、胎牛血清(FBS)(美国Hyclone公司),青霉素、链霉素(美国Hyclone公司),Annexin V试剂盒(Solarbio公司),MEX3A慢病毒由吉凯基因设计并生产。SDS-PAGE试剂(Biorad),MEX3A、CDK5、EIF2AK2、TRIM25、HDGF、LAMB3、MSI2、Flag抗体(美国abcam公司),BCA Protein Assay Kit、GAPDH抗体购自碧云天公司，裸鼠购自南京必凯生物。主要设备有生物安全柜、CO2培养箱、垂直电泳仪、化学发光成像系统、Celigo细胞成像分析仪、流式细胞仪、Tecan酶标仪等。

1.4 Western blot

细胞用RIPA裂解液进行裂解，振荡充分裂解后离心取上清。用BCA试剂盒(上海生工)测蛋白浓度。SDS-PAGE电泳用5%的浓缩胶与12%的分离胶进行。电泳后将蛋白转至PVDF膜，用5%BSA封闭。加一抗4 ℃孵育过夜。洗涤，二抗(美国Abcam公司)室温孵育，洗涤，曝光显色。

1.5 免疫沉淀反应

取10 mL PBS至新的10 mL EP管，加入400 μL Flag beads, 8 000 r/min离心5 min, 弃上清；取10 000～15 000 μg蛋白裂解液至EP管，用蛋白裂解液补齐至10 mL;4 ℃旋转孵育过夜后8 000 r/min离心5 min, 弃上清；加入3 mL TBS缓冲液，混匀，8 000 r/min离心5 min, 弃上清，再重复四次；取适量3×Flag Peptide至1 400 μL TBS,混匀；混合 液700 μL至beads, 4 ℃ 40 min温和摇匀。8 000 r/min离心5 min, 取上清至浓缩管，14 000×g离心10 min; 将剩余上清继续进行浓缩，14 000×g离心10 min; 重复14 000×g离心10 min, 直至浓缩管中液体体积<50 μL。吸取上述浓缩样品，等比例加入loading buffer, 变性后，进行SDS-PAGE电泳。

1.6 免疫组织化学染色

采用SP法检测结肠癌组织中MEX3A的表达。石蜡切片常规脱蜡，然后行抗原修复。滴加10%的正常非免疫羊血清，37 ℃孵 育60 min, PBS洗涤3次。滴加一抗工作 液(1∶100),4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次。滴加二抗工作液(稀释比例为1∶500),37 ℃孵育60 min, PBS洗涤3次。滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉卵白素，37 ℃孵育60 min, PBS洗涤3次。用DAB显色、苏木素复染、脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下拍照分析。

1.7 细胞增殖能力检测

Celigo细胞计数：将处于对数生长期的细胞接种于12孔板中，分别在接种后的第1、2、3、4、5天对细胞采用Celigo细胞成像分析仪进行计数。

MTT法检测：将处于对数生长期的细胞胰酶消化后重悬，并计数。根据实验设计接种孔数量。从铺板后第二天开始，培养终止前4 h加入20 μL 5 mg/mL的MTT于孔中，无需换液。4 h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100 μL DMSO溶解甲瓒颗粒，振荡2～5 min, 酶标仪490/570 nm检测光密度(optical density, OD)值，数据统计分析。

平板克隆形成实验：将处于对数生长期的细胞胰酶消化后重悬并计数，于6孔板中接种400～1 000个细胞/孔，置于培养箱中培养到14天，中途进行换液，并观察细胞状态。第14天加入PBS洗涤细胞1次。每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，固定细胞30～60 min, PBS洗涤细胞1次。每孔加入洁净、无杂质结晶紫染液1 000 μL 10～20 min。ddH2O洗涤细胞3次，晾干，数码相机拍照，克隆计数分析。

1.8 细胞凋亡检测

胰酶消化6孔培养板中细胞后重悬细胞，与培养上清中细胞收集于同一5 mL离心管中。1 300 r/min离心5 min, 弃上清，4 ℃预冷的D-Hanks(pH=7.2～7.4)洗涤细胞沉淀。1×binding buffer洗涤细胞沉淀一次，1 300 r/min、3 min离心，收集细胞。200 μL 1×binding buffer重悬细胞沉淀。加入10 μL Annexin V-APC染色，室温避光10～15 min, 上机检测。

1.9 细胞迁移及侵袭实验

划痕实验：用marker笔在6孔板背面划5条线，取对数期的细胞接种于6孔板中，培养24 h后，用200 μL枪头对着6孔板底部的直线划痕；用PBS清洗划下的细胞，避免落在划痕处；根据划痕的生长情况选择时间点进行拍照分析。

细胞侵袭能力检测：按照说明将50 mg/L Matrigel(美国Corning公司)1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。FN(美国sigma公司)均匀涂抹在Transwell小室的下室面，24孔板中加入500 μL含10%FBS的完全培养基，然后将Transwell小室置于孔中，上室中接种1×105个/100 μL无血清培养基重悬的细胞。37 ℃ CO2培养箱中培养24 h。取出小室，用湿棉签擦去上室面未侵袭的肿瘤细胞。用甲醇固定1 min, 然后结晶紫染色，三蒸水洗2次后在显微镜下随机选取5个视野计总数，取其平均值。

1.10 裸鼠CDX模型检测体内成瘤能力

动物实验经医院实验动物伦理委员会批准(DW-P-2023-001-01)。将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基重悬细胞并计数，离心后PBS重悬，调整细胞浓度为2×107个细胞/mL。然后在裸鼠右前肢腋下注射细胞悬液，4×106个细胞/200 μL/只。从第12天开始，每3天测量一次肿瘤大小，第21天后处死小鼠，解剖肿瘤并称重统计分析。

1.11 质谱分析

按照质谱分析要求准备蛋白样品，质谱分析由吉凯生物完成。

1.12 统计学分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0进行数据分析与作图。计数资料用频数和百分比表示，计量资料采用均数±标准差(x¯±s)表示。Kaplan-Meier分析MEX3A表达与结肠癌患者预后的关系；采用t检验分析独立样本之间的差异，采用χ2检验或Fisher确切概率法检验进行计数资料分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 MEX3A在结肠癌组织中表达显著上调且与结肠癌患者临床病理特征及预后显著相关

公共数据库分析结果表明，MEX3A在结肠癌组织中表达显著上调(图1A),且MEX3A的表达与结肠癌患者N分期和M分期显著相关(P<0.05,表1),单因素Logistics回归分析也表明，MEX3A的表达与结肠癌患者年龄、N分期、M分期及病理分级显著相关(P<0.05,表2)。临床样本验证结果进一步证实其在结肠癌肿瘤组织中的表达显著高于正常组织(P<0.01,图1B-C)。生存分析表明，MEX3A低表达患者的预后显著优于MEX3A高表达患者(图1D)。采用MEX3A慢病毒能显著降低MEX3A的表达(图1E-G)。

2.2 MEX3A促进结肠癌细胞的增殖同时抑制结肠癌细胞的凋亡

Celigo细胞计数结果显示，敲减MEX3A的表达后，HCT116及RKO细胞数量在实验5天内增长明显低于对照组(图2A-D);MTT(图2E-F)及平板克隆(图2G-H)实验结果也表明，敲减MEX3A的表达后，HCT116及RKO细胞增殖能力被显著抑制。细胞凋亡实验检测结果则表明，敲减MEX3A的表达后结肠癌细胞的凋亡显著增加(图2I-J)。

表2 MEX3A表达与结肠癌患者临床病理特征之间关系的单因素Logistics回归分析

2.3 MEX3A促进结肠癌细胞的迁移、侵袭及体内成瘤能力

敲减MEX3A的表达后，划痕实验显示结肠癌细胞的迁移能力显著降低(图3A-B),侵袭实验结果则表明结肠癌细胞的侵袭能力被显著抑制(图3C-D)。裸鼠CDX模型结果显示敲减MEX3A的表达后，结肠癌在裸鼠体内成瘤能力显著降低(图3E-G)。2.4 MEX3A通过与MSI2互作促进结肠癌细胞的恶性表型进展

通过Flag融合表达质粒过表达MEX3A(图4A)采用Flag抗体进行免疫共沉淀后电泳(图4B-C),质谱进行蛋白质定性检测(Shotgun)与MEX3A互作的蛋白质，生物信息学分析表明，CDK5、EIF2AK2、TRIM25、HDGF、LAMB3、MSI2可能与MEX3A之间存在互作，COIP验证结果表明，EIF2AK2、LAMB3及MSI2与MEX3A之间存在相互作用(图4D-E)。在敲减MEX3A表达后过表达EIF2AK2、LAMB3及MSI2,结肠癌细胞的增殖能力被不同程度恢复(图5A-B),其中过表达MSI2恢复最为显著。MTT及细胞迁移实验结果验证表明，过表达MSI2后，敲减MEX3A表达对结肠癌细胞增殖迁移的抑制效应被逆转，结肠癌细胞增殖及迁移能力被显著恢复(图5C-D)。

3、讨论

Mex3家族是由约70个氨基酸的保守区组成，其成员包括MEX3A、MEX3B、MEX3C以及MEX3D[3]。Mex-3 RNA结合家族成员A(MEX3A)最初被确定为秀丽隐杆线虫的翻译调节因子，通常分布在早期胚胎中[4]。此外，MEX3A被证明是一种可以与RNA结合的蛋白，其具有高度保守的RNA结合结构域和C端RING指结构域，MEX3A通过C端RING指结构域调节靶蛋白泛素化，从而调节靶蛋白亚细胞定位和稳定性[5,6]。研究表明，MEX3A在调节mRNA表达中发挥着非常重要的作用，从而调节多种疾病的进展，包括恶性肿瘤[7]。多项研究表明，MEX3A可以作为一种生物标记物，在胰腺癌[8]、肝癌[9]、卵巢癌[10]中都发挥着促进肿瘤进展的作用。但目前MEX3A在结肠癌中的作用机制仍尚未完全阐明。

本研究发现，MEX3A在结肠癌组织中表达显著上调且与结肠癌患者临床病理特征及预后显著相关，尤其是淋巴结转移与远处转移。之后我们通过体内及体外实验进一步验证MEX3A在结肠癌中的作用。我们的研究发现敲低MEX3A的表达可显著抑制结肠癌细胞增殖、侵袭以及迁移能力，并且促进细胞凋亡。而体内实验证实了MEX3A的敲低，降低了结肠癌在裸鼠体内成瘤能力。因此，我们推测MEX3A在结肠癌中发挥了促肿瘤作用。

为了进一步探究MEX3A如何在结肠癌中的促肿瘤作用机制，我们通过质谱分析联合生物信息学分析筛选了与MEX3A相关的互作蛋白，结果表明CDK5、EIF2AK2、TRIM25、HDGF、LAMB3、MSI2可能与MEX3A之间存在互作；其中过表达MSI2对敲减MEX3A结肠癌细胞的增殖能力恢复最显著，MTT及细胞迁移实验结果也验证了这一点。

MSI基因在1994年首次被鉴定为编码神经RNA结合蛋白(RBP),其在调节果蝇中感觉器官前体(SOP)细胞的不对称细胞分裂中起重要作用[11]。其中包括人类MSI家族的两个成员：MSI1和MSI2。MSI2主要在造血系统中表达，是造血干细胞(HSC)以及造血恶性肿瘤的重要调节剂[12]。MSI2通常通过优先与ACUUUUUAGAA基序或poly-U序列[13]、UAG基序[14]和含有UAG的基序+/-附加侧翼核苷酸[15]相互作用而与靶RNA的3' 末端结合，这允许其诱导和抑制蛋白质翻译。 进一步研究表明，MSI2 蛋白依靠 RRM 来识别目标 mRNA 的 3'-UTR,并且可能依赖于 PABP 结构域来影响翻译的启动，从而影响疾病进展，尤其在最近几年，MSI2过度表达在恶性肿瘤进展调节中的关键作用逐渐被证实[16]。MSI2在肿瘤组织中的表达升高通常与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、分化程度、对放化疗不敏感和预后不良呈正相关[16]。不仅如此MSI2还被证实与EMT标记物表达增加有关[17]。有研究表明MSI通过ZEB1-ERK/MAPK信号传导促进胰腺癌中EGF诱导的EMT[18],MSI2a在三阴性乳腺癌的发展和进展过程中表达下调[19],MSI被证实在多种肿瘤中与治疗耐药性成正相关，MEX3A也被发现具有促进肿瘤进展的作用，在LIAO等人[20]的研究中，首次报道了MSI2与MEX3A从不同方面作用于肠道干细胞(ISC),详细阐明了MSI2在维护静止状态的备用ISC中起到至关重要的作用，表达 MEX3A的ISC 在化学物质损伤后也能存活并增殖成肠上皮细胞，但是目前关于结肠癌中MEX3A与MSI的相互作用尚无研究报道。

综上所述，我们的研究发现了MEX3A的表达水平与结肠癌的进展显著相关，并且首次证实MEX3A与MSI2的互作关系，为进一步探究MEX3A在结肠癌中的作用机制提供了实验基础。但本研究仍存在一定的局限性，对MEX3A与MSI2互相作用的机制未进行详细的研究。因此，在后续的研究中，我们将进一步探讨MEX3A与MSI2互作的分子机制。

参考文献:

[7]鞠浩,黄瑛.MEX3A在肿瘤中的研究进展[J].现代肿瘤医学,2023,31(08):1558-1562.

基金资助:江苏省研究生科研与实践创新计划项目(编号:SJCX21_1154,SJCX23_1408); 江苏省双创博士(编号:202031099);江苏省淮安市创新能力建设-淮安市免疫学重点实验室(编号:HAP202002);南京医科大学苏北临床研究院转化医学创新人才项目(编号:YZHR201901,YZHR201904);

文章来源:周俊邑,沙晓锋,柳叶等.MEX3A对结肠癌细胞恶性表型的影响及其机制研究[J].现代肿瘤医学,2024,32(02):226-233.