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纯钛表面载锌聚多巴胺涂层改性及其抗腐蚀性能初探

2024-05-27 45 上传者：管理员

摘要：目的在纯钛表面制备载锌聚多巴胺涂层，并探究其生物相容性及抗腐蚀性能。方法将纯钛试件先后浸泡在多巴胺碱性溶液与硫酸锌溶液中，在试件表面形成载锌聚多巴胺涂层。以光滑钛表面以及聚多巴胺涂层改性钛表面为对照组，载锌聚多巴胺涂层改性钛表面为实验组。采用扫描电镜观察试件表面微形貌，X线能谱仪表征锌元素在聚多巴胺涂层上的结合。采用接触角测量仪检测试件表面的亲水性。体外培养L-929成纤维细胞，通过CCK-8评价改性钛表面的生物相容性。采用电化学工作站获取各组试件在人工唾液中的开路电位和极化曲线，分析载锌聚多巴胺涂层对钛表面抗腐蚀性能的影响。结果扫描电镜和X线能谱仪分析结果显示，3组试件表面的微形貌均有差异，载锌聚多巴胺涂层组试件表面有锌元素存在。涂层修饰后试件表面的亲水性增强。体外细胞实验显示，载锌聚多巴胺涂层具有良好的生物相容性。电化学测试获得的开路电位和动态极化曲线及其拟合数据显示，载锌聚多巴胺涂层组试件的抗腐蚀性能最强，聚多巴胺涂层组次之，光滑钛组最小。结论采用化学浸泡法可在钛表面成功制备载锌聚多巴胺涂层，改性钛表面具有良好的生物相容性和抗腐蚀性能。

关键词：
修复手段
抗腐蚀性能
聚多巴胺
钛表面
锌
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种植义齿是目前缺失牙的主要修复手段之一，所具备的诸多优点使其成为越来越多患者的首选。与此同时，作为永久修复体，如何在复杂的口腔环境下长期稳定地发挥功能成为需要关注的问题。长期以来，在种植体基台的制作材料中，纯钛及钛合金是首选材料[1]。钛表面覆盖有一层由TiO2组成的天然氧化膜，能有效抵御腐蚀的发生[2,3,4]。但复杂的口腔环境可导致氧化膜的破坏和金属表面的活化，使其进一步受到腐蚀和破损。因此，提高种植体基台的抗腐蚀性能是研究热点之一[5]。

聚多巴胺是一种人造黑色素材料，具有抗氧化活性、高光热转换率以及强金属离子螯合特性，其与多种金属离子的高亲和性提供了构建含金属功能性材料的思路[6,7,8]。锌是人体必需的微量元素，具有很强的抗氧化能力以及一定的抗菌作用。作为300多种酶的结构、催化或调节辅助因子，锌在碳水化合物、脂质、蛋白质和核酸的合成和降解中发挥重要的调节作用[9]。已有研究通过聚多巴胺涂层将锌离子引入处理后的钛表面，Hu等[10]报道了载锌聚多巴胺涂层增强了TiO2纳米管阵列的血液相容性、内皮细胞的黏附增殖及其抗菌性能。Ding等[11]成功在TiO2纳米管阵列表面制备了含锌-银纳米颗粒聚多巴胺薄膜，表现出良好的成骨-抗菌性能。以往研究大多着眼于聚多巴胺-金属离子涂层对钛种植体表面成骨及相关性能的提升，与此同时，基台是种植义齿上部结构的主要部件，对穿龈轮廓的塑形以及边缘封闭的形成至关重要。近年来，如何增强基台的表面性能逐渐受到国内外学者的关注，其中，涂层改性是常见的基台表面处理技术之一。截至目前，聚多巴胺-金属离子涂层用于钛基台表面改性的研究罕见报道。因此，基于口腔内复杂的电解质微环境，我们聚焦于引入锌离子的聚多巴胺涂层对纯钛表面抗腐蚀性能的影响。本研究拟利用聚多巴胺的独特性能，在光滑钛表面构建载锌聚多巴胺涂层，并初步验证其生物相容性以及抗腐蚀性能，为新型“黏膜整合”钛基台的研发和临床转化提供实验依据。

1、材料与方法

1.1 实验材料与设备

纯钛片(99.5%,宝鸡盛辉钛业有限公司),碳化硅砂纸(鹰牌，中国),Tris-HCl缓冲液(源叶，中国),盐酸多巴胺(麦克林，中国),小鼠源性成纤维细胞系L-929(中国科学院细胞库，上海，中国),胎牛血清(Gibco, 美国),DMEM培养基(Gibco, 美国),青霉素-链霉素双抗溶液(Gibco, 美国),CCK-8试剂盒(Beyotime, 中国),扫描电子显微镜(Tescan MAIA3 GMU,捷克),JC2000D接触角测量仪(Powereach, 中国),细胞恒温培养箱(Thermo, 美国),超净工作台(Thermo, 美国),P20超声清洗剂(固特，中国),铂片电极(北京精科，中国),Ag/AgCl参比电极(北京精科，中国),恒温水浴箱 HH-1(常州国华，中国),笔式pH计(联测仪表，中国),CS310H电化学工作站、CS Studio 5腐蚀测试软件(科斯特公司，中国)。

1.2 试件准备

制备纯钛(cpTi)试件(直径15 mm, 厚度2 mm),碳化硅砂纸逐级打磨(600、800、1 000、1 200目),再依次使用双蒸水、75%乙醇、双蒸水超声清洗30 min, 自然风干。用pH=8.5的Tris-HCl缓冲液配制2 mg/mL盐酸多巴胺溶液，将纯钛试件浸泡于该溶液中6 h, 取出后双蒸水冲洗，自然风干，获得纯钛-聚多巴胺涂层(cpTi-PDA)试件。将制备好的cpTi-PDA试件浸泡于硫酸锌溶液中6 h, 取出后双蒸水冲洗，自然风干，获得纯钛-载锌聚多巴胺涂层(cpTi-PDA-Zn)试件。以上共获得cpTi、cpTi-PDA、cpTi-PDA-Zn 3组试件。

1.3 SEM-EDS分析

每组随机选择3枚试件，对试件进行喷金处理后，使用扫描电镜(SEM)观察试件表面微形貌。选取相应区域，获得低倍( ×500)和高倍( ×5 000)图像。对cpTi-PDA-Zn组试件，选取低倍图像，使用X线能谱仪(EDS)对目标元素进行面分布分析。

1.4 表面亲水性检测

每组随机选择3枚试件，通过接触角测量仪采集3组试件表面的水接触角数据，并对所获水接触角数据进行计算，获得相应的表面能数据。

1.5 细胞培养

复苏L-929细胞，加入DMEM培养基(含10% 胎牛血清，1% 青霉素-链霉素双抗溶液)后，静置于恒温培养箱(恒温37 ℃,湿度95%,5% CO2)中培养，每2 d 更换一次新鲜的培养基。观察细胞状态，当达到80%的细胞融合时传代。

1.6 生物相容性实验

将L-929细胞(3×103个/孔)接种至96孔板中的3组试件表面，每组3个复孔。培养1、2、3 d后，弃培养液，PBS清洗，向微孔板中加入含10% CCK-8的无血清DMEM培养基，在培养箱内避光孵育2 h, 采用多功能酶标仪在450 nm波长处测定光密度(OD)值，OD值越高表明细胞增殖活性越好。

1.7 电解质溶液配制

采用双蒸水与分析纯配制Fusayama人工唾液[12]:NaCl 0.4 g/L、KCl 0.4 g/L、CaCl2·2H2O 0.795 g/L、Na2HPO4·2H2O 0.78 g/L、Na2S·2H2O 0.005 g/L、Urea 1 g/L、去离子水1 000 mL,在37 ℃条件下将pH值调整至6.8,4 ℃保存备用。

1.8 电化学腐蚀测试

采用经典三电极体系，实验试件为工作电极，铂片电极和Ag/AgCl电极分别为辅助电极和参比电极，以配制好的Fusayama人工唾液为电解质，每组 3个样本，在(37.0±0.5)℃条件下进行电化学腐蚀测试。三电极依次放入反应池后，与电化学工作站中的相应导线连接。先测试开路电位1 h, 待电位波动不超过2 mV时开始动电位极化测试，以1 mV/s的扫描速度，从-400 mV至3 000 mV(根据参比电极测定)记录数据。使用CS Studio5软件的曲线拟合功能分析极化曲线，在开路电位±200 mV的数据范围内，采用Tafel直线外推法确定腐蚀电位(Ecorr)、腐蚀电流密度(Icorr)、极化电阻(Rp)和腐蚀速率(CR)。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件对各组试件的表面亲水性、生物相容性以及电化学腐蚀行为数据进行方差齐性检验，显示方差齐，进行单因素方差分析和SNK多重比较，当P<0.05时表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 表面微形貌及元素组成

SEM观察各组试件表面的微形貌如图1所示，低倍镜下，各组之间无明显差异。高倍镜下，cpTi组试件表面相对光滑，可见抛光处理后的机械划痕。cpTi-PDA组试件表面见涂层样结构，表明聚多巴胺被加载至光滑钛表面。cpTi-PDA-Zn组试件表面可见涂层表面出现颗粒状沉积，提示锌离子的引入使聚多巴胺涂层发生变化，再通过EDS分析元素组成(图2)显示，cpTi-PDA-Zn组试件表面有锌元素存在。

图1 扫描电镜观察三组试件的表面微形貌

图2 EDS分析cpTi-PDA-Zn试件表面的元素组成

2.2 表面亲水性

3组试件表面的水接触角和表面能如图3所示，cpTi组、cpTi-PDA组和cpTi-PDA-Zn组试件表面的水接触角逐渐减小，其表面能平均值分别为22.81、57.53、69.92 mN/m, 呈逐渐增大趋势。该结果表明，与光滑钛相比，聚多巴胺涂层改性后的钛表面具有更好的亲水性，并且随着锌离子的加入，表面亲水性进一步增强。

图3 三组试件表面的水接触角和表面能

2.3 生物相容性

L-929细胞的增殖活性检测结果如图4所示，3组试件表面L-929成纤维细胞的增殖水平随着培养时间的延长而逐渐升高，说明细胞生长状态正常。在培养第3天时，3组试件表面的L-929细胞增殖活性无明显差异，表明聚多巴胺涂层与载锌聚多巴胺涂层改性后的钛表面相比光滑钛无明显细胞毒性。

图4 3组试件表面L-929细胞培养1、2、3 d后的增殖活性

2.4 抗腐蚀性能

在人工唾液环境下对3组试件进行电化学测试，图5为采集的开路电位图，在该介质中，cpTi-PDA-Zn组试件的开路电位值最高，cpTi组试件最低。鉴于开路电位值与腐蚀易感性在一定程度上呈负相关，3组试件的腐蚀易感性大小依次为：cpTi组>cpTi-PDA组>cpTi-PDA-Zn组。图6为采集的动电位极化曲线图，相比于cpTi组，cpTi-PDA组和cpTi-PDA-Zn组的极化曲线整体向左上方移动，该现象提示两组试件的腐蚀行为有所减弱。表1为各组极化曲线拟合后的腐蚀参数，其中腐蚀电位(Ecorr)、腐蚀电流密度(Icorr)、极化电阻(Rp)、腐蚀速率(CR)是由Tafel直线外推法获得。三组试件的腐蚀速率大小依次为cpTi组>cpTi-PDA组>cpTi-PDA-Zn组，与腐蚀电流密度和极化电阻值相对应。腐蚀电流密度是指单位面积内金属表面发生腐蚀的电流量，数值越小表示抗腐蚀性能越好。极化电阻是极化曲线在ΔE=0(即腐蚀电位处)切线的斜率，数值越大表示抗腐蚀性能越好。上述结果表明：聚多巴胺涂层改性能提供更好的抗腐蚀性能，而载锌聚多巴胺涂层可在此基础上进一步提升钛表面在人工唾液环境中的抗腐蚀性能。

图5 三组试件的开路电位图

图6 三组试件的动电位极化曲线图

表1 3组试件的腐蚀参数

不同标注字母表示组间差异有统计学意义，含相同字母表示对应组间差异无统计学意义。

3、讨论

在复杂的口腔生理环境中，随着时间的推移，钛种植基台表面的保护性氧化膜会受到不同程度的破坏，导致钛金属离子的释放，释放的钛离子可刺激种植体颈部周围的细胞和组织，诱发炎症反应和骨吸收等生物学并发症[13,14]。因此，如何提升钛基台的抗腐蚀性能是种植体系统研发中需要解决的重要技术问题。金属材料的腐蚀主要包括化学腐蚀和电化学腐蚀两类，而口腔是一个富含流动液体——唾液的复杂电解质环境，加上口内温度变化、微生物代谢活动和pH值波动等因素，钛种植基台的腐蚀主要是电化学腐蚀，因而其腐蚀行为可以通过电化学技术来评估。动电位极化测试是用于检测试样抗腐蚀性能的最广为接受的电化学技术。测试流程是以电流流经电解质，以设定的速率改变电极电位。该方法能准确测定不同电位下金属试样表面的主动/被动腐蚀率，并简便、快速地计算腐蚀速率，十分有助于探究金属试样表面发生的电化学腐蚀过程，协助局部腐蚀的检测和预防。因此，本研究主要采用动电位极化技术分析评估人工唾液环境中各组试件的腐蚀行为特征。

作为贻贝黏附蛋白的重要组成成分，聚多巴胺能够与多种金属离子以及金属相关基底结合，包括金属、金属氧化物和金属硫化物表面。聚多巴胺丰富的官能团使其成为常用的涂层材料之一[15,16],广泛用于金属[17]、金属氧化物[18]、陶瓷[19]、碳纳米管[20]和磁铁矿纳米颗粒的涂层[21],并提供了后续表面改性的可能性。聚多巴胺含有的邻苯二酚基团使其能与底物形成强共价键和非共价键，该特性赋予了聚多巴胺涂层强大的锚定能力[22]。另一方面，聚多巴胺涂层具有极强的抗降解性，即使涂层较薄，也具有出色的耐腐蚀性[23]。基于上述优点，聚多巴胺可被用于钛基植入物的表面功能化改性[24,25]。Liu等[26]研究发现，将钛片浸入聚多巴胺溶液能获得结合较为紧密的涂层，且涂层的引入显著提高了钛片表面的亲水性。在此基础上，本研究采用两步法金属离子-聚多巴胺组装策略，将锌离子成功引入聚多巴胺涂层，SEM-EDS分析结果证实：锌离子的引入改变了聚多巴胺涂层的表面形貌。我们进一步通过电化学腐蚀测试获得了3组试件的腐蚀行为特征数据。通过数据的对比分析发现，在聚多巴胺涂层改性实现抗腐蚀作用的基础上，锌离子的载入显著提高了涂层的抗腐蚀性能。该效应可能得益于金属离子螯合后对聚多巴胺的固化作用。Sever等[27]使用一种含儿茶酚的模型系统，研究其与元素周期表中第一排过渡金属螯合形成的复合物，使用紫外可见光谱仪跟踪碱滴定过程中复合物的形成情况发现，多巴胺可通过邻苯二酚基团与过渡金属离子螯合形成1∶1或1∶2的金属-多巴胺复合物。

由实验结果可知，聚多巴胺涂层可以起到保护钛基底金属的作用，提高其抗腐蚀性能。L-929细胞的增殖活性检测结果证实，聚多巴胺涂层与载锌聚多巴胺涂层改性后的钛表面均具有良好的生物相容性。因此，通过聚多巴胺与锌离子的螯合，在兼顾生物相容性的同时，涂层的抗腐蚀性能进一步增强。

综上所述，我们通过“两步法”在纯钛表面成功构建了载锌聚多巴胺涂层，再通过体外细胞实验初步检验了涂层的生物相容性，最后通过电化学实验证实其在模拟口内环境中具有优良的抗腐蚀性能。该研究结果可为钛种植基台表面有机生物涂层改性的进一步拓展提供实验依据。但载锌聚多巴胺涂层改性增强纯钛表面抗腐蚀性能的内在机理以及该新型钛表面在种植体颈部“黏膜整合”过程中的作用机制尚未明确，还有待于后续体内外实验的深入探索。

基金资助:国家自然科学基金面上项目(82271003);国家自然科学基金青年项目(82201096); 江苏高校“青蓝工程”中青年学术带头人项目;江苏省科教能力提升工程——江苏省研究型医院建设单位(YJXYYJSDW4);江苏省医学创新中心(CXZX202227);

文章来源:梅煜坤,张建兰,邱憬.纯钛表面载锌聚多巴胺涂层改性及其抗腐蚀性能初探[J].口腔医学,2024,44(05):356-361.