牙齿的发育涉及牙源性上皮和外胚间充质之间的相互作用，研究表明在牙发育过程中，细胞外基质(extracellular matrix, ECM)在上皮与间充质的交互作用过程中起重要作用，同时与细胞增殖、细胞迁移及细胞分化等细胞生物学行为密切相关[1]。小鼠牙乳头细胞(mouse dental papilla cells, mDPCs)是间充质来源的细胞，作为成牙本质细胞的祖细胞，在牙发育过程中可以分化为成牙本质细胞，进而合成、分泌牙本质，构成牙体组织的重要组成部分，在牙齿的发生和发育过程中起重要作用[2]。

多功能蛋白聚糖(Versican)是一种大分子硫酸软骨素蛋白聚糖，是ECM的重要组分，其至少有5种不同亚型，即V0、V1、V2、V3和V4[3]。Versican由一个G1亚基、一个G3亚基和二者之间的硫酸软骨素糖链(CS-GAG)结合域所组成，其中GAG结合域包含GAG-α结合域和GAG-β结合域[4]。当GAG-α和GAG-β同时存在时，形成Versican V0;当GAG-α被剪切时，形成Versican V1;当GAG-β被剪切时，形成Versican V2;当GAG-α和GAG-β同时被剪切时，则形成Versican V3。

课题组前期研究表明Versican V0、V1和V2在小鼠下颌第一磨牙发育过程中呈特殊时空表达模式[5],提示不同的Versican亚型可能在牙发育中起不同作用。其他研究表明Versican V0/V1因其共同的GAG-β结构域，对多种细胞的生物学功能存在相同作用[6,7]。但目前关于Versican V0/V1对牙发育的影响研究较少，本研究拟探索Versican V0/V1对mDPCs的增殖、迁移及分化等生物学行为的影响，为牙齿发育相关机制的理论研究提供新的依据。

1、材料与方法

1.1 主要材料和试剂

兔抗小鼠GAG-β抗体、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、胶原酶、氯化十六烷基吡啶(Sigma公司，美国),Vimentin、Cytokeratin14抗体、山羊抗兔荧光二抗及猴抗小鼠荧光二抗(Abcam公司，英国),α-MEM培养基、胎牛血清、PBS、青链霉素(Hyclone, 美国),胰蛋白酶、Opti-MEM培养基(Gibco公司，美国),LipofectamineTM 3000(Thermo公司，美国),EdU试剂盒、BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(碧云天公司，中国),茜素红试剂盒(凯基公司，中国),细胞培养皿、离心管、细胞培养板、Transwell板(Corning公司，美国),细胞总RNA提取试剂盒(Takara公司，日本)。

1.2 原代小鼠牙乳头细胞的分离培养

本实验通过同济大学伦理委员会审查，选取E16.5d C57BL/6J胎鼠(购于斯贝福(苏州)生物技术有限公司),于体视显微镜下分离下颌第一磨牙牙胚，将获取的牙乳头用Ⅰ型胶原酶消化处理，置于37 ℃,5% CO2培养箱中消化1 h, 用α-MEM完全培养基重悬后接种于培养瓶中，置于恒温培养箱中孵育。待细胞融合至80%时进行传代，取第二代细胞用于后续实验。

1.3 小鼠牙乳头细胞的鉴定

将mDPCs以1×104个/孔的密度接种于24孔板细胞爬片上，培养24 h后，用4%多聚甲醛固定，室温下置于5% Triton-X-100中处理10 min, 5% BSA封闭30 min。弃封闭液，加入一抗(Vimentin抗体1∶200,Cytokeratin14抗体1∶200)4 ℃过夜孵育。次日弃一抗，PBS冲洗，滴加荧光二抗孵育20 min, PBS冲洗，加入DAPI(1∶2 000)避光孵育15 min。封片后于倒置荧光显微镜下拍照。

1.4 小干扰RNA的合成

Versican V0/V1小干扰RNA序列：CUUUAAACGUCGAUUGAGU,由北京擎科生物科技股份有限公司上海分公司合成。

1.5 小干扰RNA转染及效果验证

实验分为2组。对照组：si-Negative(si-NC)组；实验组：si-Versican V0/V1组。细胞接种于12孔板及12孔板细胞爬片上，待细胞汇合度至80%左右进行转染。将1.25 μL siRNA与25 μL Opti-MEM培养基轻轻混匀，再将1.3 μL LipofectamineTM 3000转染试剂加入25 μL Opti-MEM培养基中轻轻混匀，最后将两种混合液混匀，室温下孵育15 min后滴加入12孔板中。转染48 h后用Trizol法抽提细胞总RNA,逆转录合成cDNA,检测Versican V0/V1的基因表达水平(引物序列见表1),对爬片进行免疫荧光染色，比较GAG-β抗体(1∶100)的表达水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 EdU实验检测小鼠牙乳头细胞增殖能力

实验分组同1.5。两组细胞于24孔板细胞爬片中转染36 h后按EdU试剂盒说明书进行染色，倒置荧光显微镜下拍照，记录阳性细胞比例。

1.7 小鼠牙乳头细胞迁移能力的检测

1.7.1 划痕实验

实验分为3组：Control组、si-NC组、si-Versican V0/V1组。mDPCs接种于12孔板，转染48 h后用200 μL枪头在孔板底部做划痕，PBS轻柔荡洗去除脱落细胞，并采集此时图像。用无血清的培养基替换原培养基，0、12、24 h后，在相同位置观察划痕愈合变化，并在显微镜下拍照，使用Image J软件处理图像，记录结果并进行统计分析。

1.7.2 Transwell实验

将Control组、si-NC组、si-Versican V0/V1组细胞饥饿处理24 h后，消化细胞，用无血清培养基重悬后接种于Transwell上室，下室加入含10%血清的培养基。培养24 h后取出Transwell小室，弃培养基，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定，PBS冲洗，随后用0.1%结晶紫染色30 min, PBS轻柔荡洗，棉签擦去残余染料，在显微镜下观察并拍照。3%醋酸溶液脱色，酶标仪测定各孔570 nm处吸光度值，记录结果并进行统计分析。

1.8 小鼠牙乳头细胞成牙分化和矿化能力的检测

1.8.1 碱性磷酸酶染色和茜素红染色

配制矿化诱导培养基(osteogenic medium, OM):α-MEM+10%胎牛血清+0.1 μmol/L地塞米松+0.05 mmol/L抗坏血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸钠；生长培养基(growth medium, GM):α-MEM+10%胎牛血清。实验分为4组：GM+si-NC组，GM+si-Versican V0/V1组，OM+si-NC组，OM+si-Versican V0/V1组。mDPCs接种于12孔板，待细胞融合度达70%时，分别加入各组培养基，每2 d换液。诱导5 d后，4%多聚甲醛溶液固定，BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒染色，拍照；诱导10 d后，4%多聚甲醛溶液固定，茜素红试剂盒染色，拍照，100 g/L氯化十六烷基吡啶脱色，将等体积溶液加入96孔板，测量各孔562 nm处OD值，记录并分析结果。

1.8.2 qRT-PCR检测成牙和矿化基因的表达情况

实验分为2组：OM+si-NC组，OM+si-Versican V0/V1组。按1.8.1方法矿化诱导培养5、10 d后，按Trizol法提取RNA,逆转录合成cDNA,检测成牙及矿化相关基因的表达量(引物序列见表1)。

1.9 统计学方法

本研究实验数据均进行了3次独立重复实验。采用GraphPad Prism9.0软件对数据进行统计学分析，结果表示为均数±标准差两组间比较采用独立样本t检验，检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 小鼠牙乳头细胞的培养及鉴定结果

培养2 d后可见大量梭形或多角形的间充质细胞(图1A),细胞融合达80%时，按1∶3比例传代培养至第二代，细胞呈梭形或多角形(图1B)。免疫荧光染色显示(图2),间充质来源细胞标志物波形蛋白(Vimentin)染色阳性，上皮来源细胞表面角蛋14(Cytokeratin 14)染色阴性，提示mDPCs为间充质来源细胞。

图1 倒置显微镜下观察原代培养的小鼠牙乳头细胞( ×40)   

图2 细胞中 Vimentin(绿色)及 Cytokeratin14(红色)的表达情况( ×200)   

2.2 小干扰RNA转染效果验证

通过qRT-PCR和免疫荧光染色分析小干扰RNA的转染效果，结果显示，与si-NC组相比，si-Versican V0/V1组的mRNA表达和荧光表达均显著降低(mRNA表达，P<0.000 1;相对荧光表达，P<0.001,图3)。

2.3 细胞增殖能力比较

EdU实验结果显示，si-Versican V0/V1组阳性细胞数目少于si-NC组，细胞增殖率降低(P<0.01,图4)。

2.4 细胞迁移能力比较

细胞划痕结果显示，培养12 h和24 h后，si-Versican V0/V1均显著抑制mDPCs的水平迁移能力(P<0.01,图5A、B)。Transwell实验结果显示，si-Versican V0/V1显著抑制mDPCs的垂直迁移能力(P<0.000 1,图5C、D)。

图3 siRNA的转染效率( ×200)   

图4 EdU实验检测mDPCs增殖能力( ×200)   

图5 划痕实验和Transwell实验检测mDPCs迁移能力   

2.5 细胞成牙分化及矿化能力的比较

矿化诱导5 d后的ALP染色结果显示，si-Versican V0/V1组染色强度明显高于si-NC组(图6A);矿化诱导10 d后的茜素红染色结果显示，si-NC组及si-Versican V0/V1组均可形成红色矿化结节，但后者的结节数量明显更多(图6B),染色结果分析显示si-Versican V0/V1组相对OD值增高(P<0.000 1,图6C);qRT-PCR结果显示，矿化诱导5 d及10 d后，si-Versican V0/V1组成牙分化和矿化相关基因表达水平较si-NC组均明显升高(P<0.05,图6D)。

图6 si-Versican V0/V1对mDPCs成牙分化及矿化的影响   

3、讨论

ECM分布于细胞外空间，不仅可以作为细胞支架为细胞生存提供微环境，还参与并驱动许多细胞生物学活动[8],包括细胞的迁移、黏附、增殖和分化等[9]。同时有研究显示，ECM参与调节牙齿的发生和发育[10]。Versican属于蛋白聚糖家族，存在于体内许多组织的ECM中，作为ECM的主要成分，在组织形态发生和维持中起重要作用。

研究证明Versican在机体发育及疾病过程中扮演重要角色。在胚胎发育时期，Versican在大脑、心、肺、软骨等器官与组织中呈高表达，其表达异常会导致这些器官与组织的发育障碍[11]。在许多影响心血管的慢性炎症性疾病中，Versican的表达增加，例如动脉粥样硬化、瓣膜性心脏病和心肌梗死等[12]。同时，在一些存在活跃组织重塑的慢性疾病中，Versican也呈高表达，如癌症、肺和气道炎症、肾脏疾病等[13]。尽管Versican在发育和疾病中发挥重要作用，但我们对其在牙发育过程中的作用仍知之甚少。以往文献报道，Versican在牙齿的软硬组织中均有表达，如牙髓组织、牙周组织、牙骨质以及牙本质等[14]。课题组前期研究也发现，在牙胚发育过程中，Versican在上皮及间充质均有表达[15],提示其可能在上皮-间充质的相互作用中发挥作用。

Versican V0/V1由于拥有共同的GAG-β结构域，通常发挥相似的生物学功能。Bigoni等[16]研究发现，Versican V0/V1基因的序列变异通过影响牙骨质的合成，使牙根丧失正常的形态。有研究发现，Versican V0/V1通过其共同的GAG-β结构域调节胶质瘤细胞的迁移，用特异性抗体在功能上阻断GAG-β结构域后，胶质瘤细胞的迁移减少[7]。Sheng等[17]研究表明，含有GAG-β结构域的V1亚型不仅与增强的细胞增殖有关，还与细胞周期进程和减少细胞凋亡有关，GAG-β结构域可能导致EGFR信号通路激活和p27降解，以及Bad的下调，用siRNA沉默V1亚型后，NIH3T3细胞的细胞增殖减弱，细胞凋亡增加。在恶性黑色素瘤细胞中，Versican V0/V1的沉默导致其细胞增殖和细胞迁移减少，同时对Ⅰ型胶原蛋白、层黏连蛋白和纤维连接蛋白的黏附增加，表明Versican V0/V1在调节恶性黑色素瘤细胞的行为中发挥重要作用[6]。本研究发现，沉默Versican V0/V1后，mDPCs的增殖能力及迁移能力减弱。在牙齿发育过程中，上皮与间充质之间异常的增殖、凋亡及迁移等都可能导致牙发育的缺陷及功能的异常，因此Versican V0/V1对mDPCs增殖和迁移能力的影响提示其可能与牙发育过程密切相关。

Versican在牙胚发育过程中呈特殊的时空表达模式，在细胞增生活跃区表达明显，而在已分化的细胞区域则无明显表达[18],星网状层和邻近Hertwig上皮根鞘的牙间充质细胞只表达V1,成熟的成牙本质细胞主要表达V2,而牙乳头和成釉细胞可能都表达V0/V1/V2[5],提示其可能与上皮-间充质的相互作用及相关细胞的增殖、分化有关。但关于Versican在牙发育过程中对细胞分化的影响还少有研究，本实验进一步研究了Versican V0/V1在成牙分化和矿化中的调控作用。牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)是公认的牙源性标志物，在牙本质形成和矿化中发挥重要作用，DSPP基因的缺失会影响成牙细胞谱系的正常分化，导致间充质干细胞分化为软骨样细胞[19]。Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)在骨形成、成骨细胞分化及矿化中起重要调控作用。RUNX2在早期阶段作为成骨细胞分化的调节剂，在骨骼形态发生、牙齿发育、软骨生成和血管生成中发挥作用[20]。ALP是钙化机制中最早的功能基因之一，对硬组织的形成起至关重要的作用[21]。本研究显示，沉默Versican V0/V1后，碱性磷酸酶染色更深且矿化结节数量增加，且在矿化诱导5 d和10 d后，ALP、DSPP和RUNX2的基因表达水平均上升，表明沉默Versican V0/V1可促进mDPCs的成牙分化和矿化，从而推测Versican V0/V1参与牙发育过程中的成牙分化和矿化过程。

综上所述，本研究结果显示，使用siRNA沉默Versican V0/V1后，抑制了mDPCs的增殖和迁移，但能促进mDPCs的成牙分化和矿化，表明Versican V0/V1可能与牙齿发育过程密切相关，具体机制仍有待深入研究，在此基础上为牙齿发育相关机制的理论研究提供新的依据。

参考文献:

[18]蒋备战,柴田俊一,王佐林.Versican在ICR胎鼠下颌第一磨牙牙胚发育过程中的表达[J].实用口腔医学杂志,2009,25(5):626-629.

基金资助:上海市卫生健康委员会科研项目(202140357);上海申康医院发展中心新兴前沿技术联合攻关项目(SHDC12023115,SHDC12022120);

文章来源:吴佳艳,黄海燕,宋宸宇,等.沉默Versican V0/V1对小鼠牙乳头细胞生物学行为的影响[J].口腔医学,2024,44(05):349-355.