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XLαs通过影响线粒体功能调控颅骨发育的研究

2024-07-25 45 上传者：管理员

摘要：目的:本研究旨在探究超大型刺激性G蛋白α亚单位(extra-large stimulatory G protein alpha subunit, XLαs)在小鼠颅骨发育和成骨分化中的功能及分子机制。方法:通过构建XLαs第一外显子敲除的小鼠模型，运用阿尔新蓝茜素红染色技术分析颅骨表型变化。从小鼠颅骨中分离原代颅骨成骨细胞，进行体外培养并诱导成骨分化，同时通过实时荧光定量聚合酶链反应和RNA测序技术对基因表达及其功能进行分析。结果:实验结果显示，XLαs敲除小鼠颅缝宽度增加(P<0.05),颅骨未矿化区域明显增多(P<0.001),且成骨分化能力受抑制(P<0.01)。RNA测序进一步揭示XLαs缺失影响了线粒体功能。结论:本研究证实了XLαs在调节颅骨发育和成骨分化中的关键作用，特别是通过影响线粒体功能来发挥其调控效应。这一发现为针对GNAS突变导致的颅骨发育异常提供了新的治疗策略，具有潜在的临床应用价值。

关键词：
Gsα
矿化
神经内分泌蛋白55
超大型刺激性G蛋白α亚单位
颅骨发育
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GNAS基因是一种印记基因，位于人类20号染色体上，在调控多种细胞外因子的分泌以及参与细胞内信号传导中具有重要作用[1]。该基因通过特定启动子剪接编码产生多种基因产物，包括编码刺激性G蛋白α亚单位(stimulatory G protein alpha subunit, Gsα)、超大型刺激性G蛋白α亚单位(extra-large stimulatory G protein alpha subunit, XLαs)和神经内分泌蛋白55(neuroendocrine secretory protein 55, NESP55),以及非编码蛋白A/B (non-coding protein A/B)和反义转录本AS(antisense transcript AS)[2]。在大多数组织中，父系和母系等位基因都会转录Gsα,但XLαs、A/B和AS仅由父系转录表达，这与其母体启动子在差异甲基化区域内的甲基化有关[3],GNAS基因上的突变导致多种骨骼缺陷性疾病，如奥尔布赖特综合征、骨纤维异常增殖症和进行性骨异生，其中奥尔布赖特综合征患者以身材矮小和先天性骨骼发育异常为主要特征[4]。部分临床病例研究指出，GNAS突变的患者可出现颅骨发育异常[5,6],近年来有研究证实Gsα缺失造成颅骨畸形和异位成骨[7,8],但有关XLαs在颅骨发育及成骨分化中的作用尚未见相关报道。

Plagge等[9]在2004年首次构建了XLαs敲除小鼠，发现XLαs敲除小鼠不仅体重减轻、吮吸功能障碍，而且体型明显窄而瘦。本研究通过构建新的XLαs条件敲除小鼠模型，探索其对颅骨发育的影响。通过使用阿尔新蓝茜素红骨骼染色技术和小鼠原代颅骨成骨细胞的体外矿化诱导实验，比较分析XLαs敲除小鼠与同窝对照小鼠中颅骨发育和成骨分化的差异，并通过生物信息学分析和关键通路中相应基因的验证，就XLαs在颅骨发育中的作用机制进行了深入探讨。

1、材料与方法

1.1 实验动物

本实验使用的小鼠来自本课题组构建的可进行条件性敲除的GNAS基因flox小鼠(上海南方模式生物科技股份有限公司，中国)。该构建方案针对的转录本为Gnas-223(ENSMUST00000185956.6),flox针对XLαs特异的第一外显子。由于XLαs仅由父系转录表达，因此本实验选用雄性XLαs flox/flox小鼠和雌性CMV-cre杂合小鼠(鼠来宝武汉生物科技有限公司，中国)交配，以获得XLαs敲除(KO)和未敲除(WT)的子代小鼠进行后续实验。动物饲养在武汉大学口腔医学院SPF级动物实验室中，本研究涉及的动物实验均按照武汉大学动物保护和动物伦理委员会批准的方案(S07922040A)进行。

1.2 主要试剂

α-MEM培养基、胎牛血清(Gibco, 美国);青霉素-链霉素、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS,Hyclone, 美国);0.25%胰蛋白酶(Gibco, 美国);Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶(Biosharp, 中国);地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、氯化十六烷吡啶(Solarbio, 中国);碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)显色试剂盒(Merck, 德国);ALP活性检测试剂盒(Abcam, 英国);TRIzol(Thermo Fisher Scientific, 美国);RNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek, 美国);逆转录试剂(翌圣，中国);实时荧光定量PCR试剂(翌圣，中国);阿尔新蓝(alcian blue)染料(Biosharp, 中国);茜素红S(alizarin red S,ARS)染料、氢氧化钾(KOH)、乙酸、无水乙醇、丙三醇(甘油)(国药集团化学试剂有限公司，中国)。

1.3 实验方法

1.3.1 阿尔新蓝茜素红骨骼染色

阿尔新蓝茜素红染色法参考文献[10]中的方法，针对出生后0.5 d(PN0.5)的小鼠，在去除皮肤后将标本置于95%乙醇中室温固定24～48 h。随后，使用阿尔新蓝溶液进行染色3 d, 接着使用2%KOH溶液处理12～24 h, 最后进行茜素红溶液染色24 h。为了使骨骼完全清晰，将其浸泡在1%KOH/20%甘油溶液中，最后将标本置于1%KOH/50%甘油溶液中，在体视显微镜下进行拍照。

1.3.2 原代颅骨成骨细胞培养

原代颅骨成骨细胞提取方法参考文献[11]中的方法，本实验取PN0.5小鼠分离颅骨，去除骨膜后剪碎，将其置于适量蛋白酶(Ⅰ型胶原酶∶Ⅱ型胶原酶=1∶3)中，在37 ℃培养箱中消化4次，每次20 min, 前2次的消化液弃掉，收集第3～4次消化液，离心后加入含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的α-MEM培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养，每隔2 d观察细胞状态并根据其情况换液或传代。

1.3.3 ALP染色及活性定量检测

12孔板每孔接种1.0×104个细胞，待细胞融合至70%时加入配制好的矿化诱导液(含10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10 nmol/L地塞米松和50 μg/mL抗坏血酸)进行培养，每2～3 d换液，培养1周后去除培养基，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定2 min, PBS洗涤3次，按照试剂盒说明书准备好ALP染色液进行染色，室温避光孵育15 min, PBS洗去染色液，观察各组染色情况。在进行了1周的矿化诱导后，去除培养基并用PBS洗涤3次。随后，将50 μL含有测定缓冲液的细胞裂解液加入96孔板中，并加入50 μL对硝基苯磷酸酯，样品在25 ℃的避光条件下孵育60 min, 随后加入20 μL终止溶液，用酶标仪测定405 nm的吸光度(A)值进行ALP活性定量分析。

1.3.4 茜素红染色及矿化结节定量检测

12孔板每孔接种1.0×104个细胞，待细胞融合至70%时加入配制好的矿化诱导液进行培养，每2～3 d换液，培养3周后去除培养基，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定10 min, PBS洗涤3次，加入1%茜素红S染色5～10 min, PBS 洗去染色液，观察形成的矿化结节情况。随后，每孔加入10% 氯化十六烷吡啶，在室温孵育2 h, 用酶标仪测定570 nm的A值进行定量分析。

1.3.5 实时定量逆转录聚合酶链反应细胞培养至合适密度，弃去培养基，用无酶PBS洗涤3次，使用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,使用逆转录试剂将RNA逆转录为cDNA。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参，使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix试剂进行 qRT-PCR反应。引物序列详见表1。

表1qRT-PCR引物序列

1.3.6 RNA测序分析

分别从WT组和KO组小鼠的颅骨中提取总RNA,样本送至深圳华大基因公司进行后续实验。在实验开始之前，该公司先对两组RNA样本进行了质检，确保其质量符合要求。合格后，进行了RNA测序及生物信息学分析。

1.4 统计学分析

所有实验均重复3次或设置3个以上生物重复样本。使用GraphPad Prism 9软件分析，结果用

表示。两组比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 成功构建XLαs敲除小鼠

本研究对GNAS基因的XLαs特异第一外显子进行flox修饰(图1a),通过与CMV-cre杂合小鼠交配获得XLαs敲除小鼠(KO)和同窝对照小鼠(WT)。在出生后0.5d,KO小鼠表现为胃内仅有极少的乳汁(图1b),与Plagge等[9]构建的XLαs敲除小鼠表型一致。KO小鼠体重[(1.24±0.19)g]较WT小鼠[(1.40±0.15)g]显著降低(P<0.01)。为了分析XLαs的表达情况，本研究使用qRT-PCR方法检测了已报道过XLαs高表达的心脏和脑组织，结果发现KO小鼠的XLαs已成功被敲除(P<0.0001),且不影响GNAS基因其他产物的转录表达。同时，在颅骨内也检测到XLαs的成功敲除(P<0.001),而Gsα的表达水平未受影响(表2)。以上结果表明本实验成功构建了XLαs特异性敲除的小鼠模型。

图1建构XLαs敲除小鼠模型

2.2 XLαs敲除小鼠颅骨发育异常

对PN0.5 WT和KO小鼠的颅骨进行阿尔新蓝茜素红染色，结果显示XLαs的缺失导致颅缝明显增宽[WT组：(0.92±0.10) mm; KO组：(1.36±0.42) mm,P<0.05],见图2a。侧面大体观提示KO小鼠颅骨未矿化区域显著增多(图2b),阿尔新蓝染色区域占比结果显示KO小鼠颅骨的未矿化区域增加(WT组：0.42±0.03;KO组：0.56±0.06,P<0.001)。以上结果表明XLαs敲除导致小鼠颅骨发育异常。

2.3 XLαs缺失抑制成骨分化

我们提取了PN0.5 WT和KO小鼠颅骨的RNA,进行了qRT-PCR分析，结果显示成骨分化标志基因ALP、骨钙素(osteocalcin, OCN)和Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的mRNA表达量明显下降(P<0.01,表3)。同时，对从WT和KO小鼠中分离出的原代颅骨成骨细胞进行了1周和3周的成骨分化诱导，对分化后的细胞进行ALP和ARS染色，结果提示KO小鼠来源的颅骨成骨细胞的成骨分化能力显著降低(图3)。

表2WT和KO小鼠的颅骨、心脏、脑组织中XLαs和Gsα的表达水平

图2XLαs敲除小鼠颅骨发育异常

颅骨阿尔新蓝茜素红染色，侧面大体观，比例尺=1 mm

表3WT和KO小鼠颅骨中成骨标志基因的表达水平

图3ALP染色和ARS染色提示XLαs缺失抑制成骨分化

ALP活性的定量分析结果显示KO组(1.38±0.29)较WT组(3.18±0.64)明显下降(P<0.001)。此外，在诱导成骨分化3周时，ARS染色定量显示KO组矿化结节含量(2.10±0.49)远低于WT组(4.40±0.88),差异有统计学意义(P<0.01)。上述结果提示XLαs的缺失抑制了颅骨成骨细胞的成骨分化能力。

2.4 XLαs缺失影响线粒体功能

使用从WT和KO小鼠提取的颅骨进行 RNA测序分析，结果显示有45个基因表达显著上调，9个基因表达显著下调(图4)。通过对RNA测序结果中的下调基因进行GO分析(Gene Ontology analysis),发现XLαs基因的缺失会导致细胞内氧化呼吸反应被抑制，线粒体功能障碍(表4)。qRT-PCR结果进一步验证了在XLαs敲除小鼠的颅骨中，线粒体内的能量代谢以及功能调控蛋白肽基脯氨酰异构酶F(pepti-dylprolyl isomerase F,Ppif)、苹果酸脱氢酶1(malate dehydrogenase 1,Mdh1)、细胞色素C,体细胞(cytochrome c, somatic, Cycs)和酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员 1(acyl-CoA synthetase long chain family member 1,Acsl1)的mRNA表达量显著下调(P<0.05),表明XLαs的缺失会影响线粒体功能(表5)。综上所述，这些结果提示XLαs可能通过影响线粒体功能来调控颅骨发育。

图4对RNA测序结果中的差异基因进行火山图分析

表4对RNA测序结果中的下调基因进行GO分析，提示XLαs缺失造成线粒体功能受影响

表5WT和KO小鼠颅骨中线粒体功能相关基因的表达水平

3、讨论

既往研究已经揭示了Gsα对小鼠颅骨发育的影响[7,8],尽管XLαs在结构上与Gsα相似，然而越来越多的研究表明两者在功能上存在差异[12,13]。因此，本研究对XLαs在颅骨发育中的作用进行了探索。本研究成功构建了XLαs敲除小鼠模型，并深入探究了其对颅骨发育和成骨分化的影响。本研究发现，XLαs在颅骨的正常发育中发挥重要作用，其缺失导致颅骨发育异常，影响小鼠的生存和发育。此外，本研究还发现XLαs缺失抑制了线粒体功能，进而导致骨代谢紊乱。

骨组织的发育可分为软骨内成骨和膜内成骨两种方式[14]。在软骨内成骨过程中，长骨中的间质细胞首先分化为软骨细胞，随后被骨细胞所替代，完成骨组织的形成。相比之下，颅骨的膜内成骨方式有所不同，间充质细胞直接分化为成骨细胞，通过分泌胶原蛋白和其他骨基质成分促进骨基质的沉积和矿化，最终形成新的骨组织[15]。成骨细胞的正常增殖、分化和矿化对于维持骨稳态至关重要[16]。线粒体作为细胞内的重要能量代谢中心，其功能状态对于骨代谢和骨稳态具有重要影响[17]。成骨细胞内的信号传导、蛋白质合成和细胞骨架重塑都依赖于三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的供应，而线粒体功能异常会降低ATP的产生，从而影响这些过程，进而影响成骨细胞的正常功能[18]。近年来的研究发现，线粒体功能异常可能会导致骨代谢紊乱，进而影响骨骼的健康和功能[19]。本研究发现XLαs缺失的小鼠颅骨中线粒体功能受到抑制，导致骨代谢紊乱，影响颅骨的正常发育和功能，这一发现进一步强调了线粒体在骨组织发育和骨稳态中的重要作用。

虽然本研究确认了XLαs在颅骨生长发育过程中扮演着至关重要的角色，但是研究的不足之处在于未进行挽救实验来验证XLαs缺失引起的异常是否可逆。为了进一步明确XLαs的功能，本课题组将在未来的研究中采用以下方法：通过颅骨局部注射可过表达XLαs的腺相关病毒或构建XLαs转基因小鼠，实现XLαs的过表达，以观察异常的颅骨生长发育是否能够被逆转，进一步确认XLαs对颅骨生长发育的调控作用。

综上，本研究发现敲除XLαs的小鼠出现明显的颅骨发育异常和成骨分化受损，并揭示了线粒体功能异常可能是影响该过程的一个关键因素。这些发现对于深入理解XLαs在骨骼发育中的功能具有重要意义。进一步探究XLαs的作用机制和与骨骼疾病的关联将有助于为相关疾病的诊断和治疗提供新的理论依据。

基金资助:国家自然科学基金(编号:82072483);

文章来源:左祎怡,何青.XLαs通过影响线粒体功能调控颅骨发育的研究[J].口腔医学研究,2024,40(07):587-592.