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小檗碱通过下调miR-1290缓解高糖诱导的足细胞损伤研究

2021-09-23 56 上传者：管理员

摘要：目的探究小檗碱对高糖诱导的足细胞损伤的影响及其对miR-1290的调控作用。方法采用高糖诱导小鼠肾足细胞MPC5建立细胞损伤模型,给予不同浓度(1.0、2.5、5.0μmol/L)小檗碱进行干预,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用Westernblotting法检测细胞B淋巴细胞瘤2(B-celllymphoma2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associatedXprotein,Bax)蛋白表达情况;采用ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)水平;采用qRT-PCR法检测miR-1290mRNA表达情况。将阴性对照(miR-NC)和miR-1290模拟物(miR-1290mimics)分别转染至MPC5细胞,给予5μmol/L小檗碱进行干预,考察miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的细胞凋亡及炎性因子分泌的影响。结果与对照组比较,模型组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05),Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05),上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高(P<0.05),miR-1290mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,小檗碱组细胞凋亡率显著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05),上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著降低(P<0.05),miR-1290mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与小檗碱+miR-NC组比较,小檗碱+miR-1290mimics组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05),Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05),上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高(P<0.05)。结论小檗碱能够通过下调miR-1290表达抑制高糖诱导的足细胞凋亡及炎性反应,从而减轻细胞损伤。

关键词：
miR-1290
凋亡
小檗碱
炎性反应
足细胞
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糖尿病肾病是糖尿病常见并发症之一，属于慢性微血管病变，可导致终末期肾病。研究表明，足细胞数量减少可影响肾小球滤过屏障结构，进而影响肾功能；足细胞凋亡与氧化应激、炎性反应密切相关，减轻足细胞损伤可保护肾功能[1]。许多中药提取物及其活性成分具有抗炎、抗氧化等作用，可减轻高糖诱导的足细胞损伤[2,3,4]。小檗碱具有抗炎、抗氧化等作用，可抑制神经退行性疾病的发生及发展，并可通过作用于转化生长因子-β1）/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B途径减轻高糖诱导的肾小球系膜细胞损伤[5]。miR-1290在糖尿病患者中表达升高，可能参与糖尿病的发生[6]。本研究采用高糖诱导足细胞建立细胞损伤模型，探讨小檗碱对高糖诱导的足细胞凋亡、炎性反应的影响，并探究及其对miR-1290的调控作用。

1、材料

1.1细胞

小鼠肾足细胞MPC5购自上海通派生物科技有限公司。

1.2药品与试剂

小檗碱（质量分数≥96%，批号HR1502）购自美国Sigma公司；DMEM培养基（批号12100046）、胎牛血清（批号10099）购自美国Gibco公司；Trizol试剂（批号15596018）购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂（批号4368813）、qRT-PCR试剂（批号11736051）购自美国ThermoFisherScientific公司；Lipofectamine2000（批号20181213）、细胞凋亡试剂盒（批号20181116）购自北京索莱宝科技有限公司；白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)ELISA试剂盒（批号20181003）购自上海臻科生物科技有限公司；IL-1βELISA试剂盒（批号20181006）购自上海瑞番生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（批号20180906）购自南京森贝伽生物科技有限公司；阴性对照（miR-NC）、miR-1290模拟物（miR-1290mimics）购自上海吉玛制药技术有限公司；兔抗鼠B淋巴细胞瘤2(B-celllymphoma2,Bcl-2）抗体（批号sc-7382）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associatedXprotein,Bax）抗体（批号sc-7480）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）抗体购自美国SantaCruz公司；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（批号20181017）购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3仪器

FACSCalibur流式细胞仪（美国BeckmanCoulter公司）；酶标仪（美国ThermoFisherScientific公司）；StepOnePlusqRT-PCR仪（美国ABI公司）。

2、方法

2.1细胞培养

MPC5细胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞融合度达到80%进行传代培养。

2.2小檗碱对MPC5细胞存活率的影响

取处于对数生长期的MPC5细胞，以2.5×105/mL接种于96孔板，培养12h。设置对照组和小檗碱（1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L）组，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养24h。加入100μLMTT溶液孵育4h，弃上清，加入二甲基亚砜（DMSO），振荡至结晶完全溶解，采用酶标仪测定490nm处的吸光度（A），计算细胞存活率。

2.3小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响

取处于对数生长期的MPC5细胞，以2.5×105/mL接种于6孔板，培养12h。设置对照组、模型组和小檗碱（1.0、2.5、5.0μmol/L）组，模型组和各给药组加入含30mmol/L葡萄糖的培养基，各给药组再加入相应药物，对照组加入含5.5mmol/L葡萄糖的培养基，培养24h[7,8]。收集细胞，加入预冷的PBS溶液洗涤，弃上清，加入500μLBindingBuffer，分别加入5μLAnnexinV-FITC和5μL碘化丙啶（PI），充分混匀，室温避光孵育10min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.4小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞凋亡相关蛋白表达的影响

按“2.3”项下方法分组并处理细胞，收集细胞，加入RIPA裂解液，提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，加入上样缓冲液，沸水煮10min使蛋白变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，室温封闭2h，分别加入Bcl-2、Bax和GAPDH抗体（1∶1000),4℃孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（1∶2000），室温孵育1h，以TBST溶液洗涤，加入ECL发光液显影，采用ImageJ软件分析条带灰度值。

2.5小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响

按“2.3”项下方法分组并处理细胞，收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书测定上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

2.6小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞miR-1290mRNA表达的影响

按“2.3”项下方法分组并处理细胞，收集细胞，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。将U6作为内参，引物序列：miR-1290上游引物5’-TGGATTTTTGGATCAG-GGA-3’，下游引物5’-CGCGTGGATTTTTGGATC-AGGGA-3’;U6上游引物5’-ATTGGAACGATAC-AGAGAAGATT-3’，下游引物5’-GGAACGCTTCA-CGAATTTG-3’。

2.7miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响

取处于对数生长期的MPC5细胞，以2.5×105/mL接种于6孔板。设置小檗碱（5μmol/L)+miR-NC组、小檗碱（5μmol/L)+miR-1290mimics组，待细胞分化成熟后，分别将miR-NC和miR-1290mimics转染至细胞内，转染6h后将培养基更换为含5μmol/L小檗碱、30mmol/L葡萄糖的培养基，培养24h。收集细胞，按“2.3”项下方法检测细胞凋亡情况。

2.8miR-1290对小檗碱调控高糖诱导的MPC5细胞凋亡相关蛋白表达的影响

按“2.7”项下方法分组并处理细胞，按“2.4”项下方法检测Bcl-2和Bax蛋白表达情况。

2.9miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响

按“2.7”项下方法分组并处理细胞，按“2.5”项下方法检测上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

2.10统计学处理

应用SPSS21.0软件分析数据，计量资料以s表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

3、结果

3.1小檗碱对MPC5细胞存活率的影响

如表1所示，与对照组比较，小檗碱（10.0、20.0μmol/L）组细胞存活率显著降低（P<0.05），因此选择1.0、2.5、5.0μmol/L小檗碱进行后续实验。

3.2小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响

如图1和表2所示，与对照组比较，模型组细胞凋亡率显著升高（P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P<0.05),Bax蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，小檗碱（2.5、5.0μmol/L）组细胞凋亡率显著降低（P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P<0.05),Bax蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。

3.3小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响

如表3所示，与对照组比较，模型组上清液IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，小檗碱（2.5、5.0μmol/L）组上清液IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著降低（P<0.05）。

3.4小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞miR-1290mRNA表达的影响

如表4所示，与对照组比较，模型组细胞miR-1290mRNA表达水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，小檗碱（2.5、5.0μmol/L）组细胞miR-1290mRNA表达水平显著降低（P<0.05）。

3.5miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响

如图2和表5所示，与小檗碱+miR-NC组比较，小檗碱+miR-1290mimics组细胞miR-1290mRNA表达水平显著升高（P<0.05），细胞凋亡率显著升高（P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P<0.05),Bax蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。

3.6miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响

如表6所示，与小檗碱+miR-NC组比较，小檗碱+miR-1290mimics组细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高（P<0.05）。

4、讨论

足细胞损伤在糖尿病肾病发展过程中发挥重要作用，通过监测足细胞数量与形态的变化可预测糖尿病肾病的发生及发展。目前尚缺乏有效防治足细胞损伤的手段，研究发现，中药的活性成分具有减轻足细胞损伤的作用[9]。红景天苷能够通过上调血红素加氧酶-1的表达从而抑制高糖诱导的足细胞凋亡及氧化应激[10]；藏红花素能够通过抑制核转录因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB）信号通路，从而抑制高糖诱导的足细胞氧化应激及炎性反应[11]；小檗碱可减轻6-羟基多巴胺诱导的神经细胞损伤[12]；小檗碱可通过抑制炎性反应，有效改善肾脏缺血再灌注大鼠的肾功能[13]；小檗碱可抑制脂多糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞自噬，从而减轻细胞损伤[14]。本研究结果显示，经高糖诱导的MPC5细胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平升高，与文献报道一致[15]，提示足细胞损伤模型制备成功；小檗碱显著降低高糖诱导的MPC5细胞凋亡率，上调Bcl-2蛋白表达水平，下调Bax蛋白表达水平，提示小檗碱可抑制高糖诱导的足细胞凋亡；经高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高，与文献报道一致[16]；小檗碱显著降低上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，提示小檗碱可抑制高糖诱导的足细胞炎性反应。

本研究发现，高糖诱导的MPC5细胞miR-1290mRNA表达水平升高，小檗碱可显著降低miR-1290mRNA表达水平，提示小檗碱可能通过下调miR-1290表达从而减轻足细胞损伤。研究表明，miR-1290在糖尿病肾病患者中的表达升高，可能作为糖尿病肾病临床诊断的潜在生物学标记物[17]。为进一步探究小檗碱对高糖诱导的足细胞损伤的作用机制，采用过表达miR-1290联合小檗碱作用于高糖诱导的MPC5细胞，结果显示，MPC5细胞凋亡率升高，上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高，提示过表达miR-1290可明显逆转小檗碱对高糖诱导的足细胞凋亡及炎性反应的作用。

综上所述，小檗碱能够通过下调miR-1290表达，从而抑制高糖诱导的足细胞凋亡及炎性反应。miR-1290可作为小檗碱治疗糖尿病肾病的潜在靶点，但其具体作用机制尚需进一步探究。

参考文献：

[1]沈倩,赵鼎,王利,等.黄芪汤对高糖诱导足细胞损伤的保护作用及机制研究[J].现代中西医结合杂志,2020,29(5):457-462.

[2]马媛,张大鹏,汪想.红枣色素通过调控miR-290-3pMST1表达对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响及机制[J].热带医学杂志,2020,20(1):6-12.

[3]段荣,夏林蒋健等白花丹参水提取物通过调控NOD2基因表达对高糖诱导小鼠肾脏足细胞损伤的保护作用及其机制研究[J免疫学杂志,2020,36(9).777-783.

文章来源：杨晶晶,沈宗姮,何沛原,刘玉萍.小檗碱通过下调miR-1290缓解高糖诱导的足细胞损伤研究[J].中草药,2021,52(18):5620-5625.