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流体剪切力通过激活Piezo 1蛋白促进肾小球内皮细胞凋亡

2024-09-03 194 上传者：管理员

摘要：目的探讨流体剪切力（FS）对肾小球内皮细胞（GECs）凋亡的影响及Piezo 1蛋白在其中的作用。方法对SD大鼠肾小球内皮细胞进行培养，使用Flexcell-T5000拉力仪模拟流体剪切力刺激，使用流式细胞测量技术检测细胞凋亡水平，通过免疫荧光染色试验检测Piezo 1蛋白在GECs中的表达水平。使用Ca2+指示剂（Cal-590 AM）观察流体剪切力对Piezo 1通道的激活作用。使用化学激动剂Yoda1、抑制剂GsMtx 4及慢病毒Lv-shPiezo 1调控Piezo 1蛋白功能或表达后，观察Piezo 1对GECs凋亡的影响。结果与对照组相比，剪切力组细胞凋亡率增高（P<0.05）,且随着流体剪切力强度升高，细胞凋亡率增高；Piezo 1在GECs中普遍表达，且流体剪切力可以激活Piezo 1通道并增强其表达；激动剂Yoda 1可以促进GECs的凋亡，抑制剂GsMtx 4可以抑制流体剪切力诱导的凋亡；Lv-shPiezo 1敲低GECs中Piezo 1的表达，且敲低组GECs的凋亡率较对照组及Lv-Ctrl组降低（P<0.05）。结论流体剪切力通过激活Piezo 1蛋白及增强其表达促进GECs的凋亡。

关键词：
FS
Piezo 1
Yoda 1
流体剪切力
肾小球内皮细胞
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高血压肾损害是一种由原发性高血压引起的肾脏微小结构及功能不可逆受损的疾病[1]。高血压导致的肾脏血管内的流体剪切力(fluid shear, FS)升高与肾损害发病机制密切相关[2]。多项研究表明，流体剪切力诱导血管内皮细胞、肾小管内皮细胞、角膜上皮细胞、软骨细胞、成骨细胞等多种细胞凋亡[3]。也有研究表明，在高血压肾损害的发展过程中，肾小球内血管流体剪切力增高可导致肾小球结构损害[4]。但是流体剪切力的升高与肾小球内皮细胞(glomerular epithelial cells, GECs)凋亡之间的关系尚不明确。

Piezo 1蛋白是一种机械敏感离子通道蛋白，它参与细胞对外界机械刺激的反应[5]。Piezo 1蛋白通过增强Ca2+离子内流，改变细胞内钙信号传导，帮助细胞将机械信号转化为生物信号，进而调节细胞增殖、分化、迁移、凋亡等生物学过程[6]。Piezo 1广泛分布于全身， Piezo 1的激活与多种细胞凋亡密切相关[7]。本研究使用Flexcell细胞拉力仪模拟流体剪切力，并通过激动剂Yoda1、抑制剂GsMtx 4及敲低Piezol的慢病毒改变其功能或表达，进而观察流体剪切力及Piezo 1蛋白在GECs凋亡中所起作用，为探究高血压肾损伤的机制提供新的思路。

1、材料与方法

1.1 材料

仪器与试剂：Flexcell T5000拉力仪(FX-5000C)及拉力培养板(Flexcell公司);ChemiDoc成像系统及超敏ECL化学发光试剂盒(Bio-Rad公司);SD大鼠肾小球内皮细胞(武汉普诺赛科技公司);DMEM培养基、胎牛血清(上海逍鹏生物科技有限公司);青霉素-链霉素溶液、annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒、RIPA裂解缓冲液、BCA测定试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司);0.05%胰蛋白酶EDTA(Hyclone公司);Piezo 1抗体、Gapdh抗体(武汉三鹰生物科技有限公司);Cal-590 AM钙离子荧光探针(上海懋康生物科技有限公司);Piezo 1激动剂Yoda 1试剂(Sigma-Aldrich公司);Piezo 1抑制剂GsMTx 4试剂(MCE公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：

SD大鼠肾小球内皮细胞用含有DMEM培养基、10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的完全培养基培养，培养条件设置为5% CO2及37 ℃。分组：检测不同机械强度(按照施加形变量的程度)对细胞凋亡影响时，分为5个组：对照组、5%形变量组、10%形变量组、15%形变量组及20%形变量组，对照组不给予机械刺激；检测Piezo 1对细胞凋亡影响过程中，分为对照组、Yoda 1组、剪切力组、剪切力+GsMtx 4组；验证Piezo1敲低对细胞凋亡影响的过程中，分为剪切力组、剪切力+Lv-Ctrl组，剪切力+Lv-shPiezo 1组。

1.2.2 Flexcell T5000拉力仪模拟流体剪切力：

将GECs接种于拉力培养板中，当细胞融合率达到80%～90%时，用机械刺激处理细胞。使用Flexcell-T5000 细胞拉力仪模拟流体剪切力刺激，机械刺激的参数选择为0.5 Hz, 拉伸变形(elongation)5%～20%,持续时间36 h, 周期模式为正弦周期。中等凋亡率的形变量用于后续测试[8]。

1.2.3 细胞凋亡流式检测：

GECs用0.05%胰蛋白酶EDTA消化后收集。随后，按照annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒说明书进行试验，使用流式细胞计数仪检测。通过annexin V-PE+/7-AAD+细胞(晚期凋亡细胞)计算细胞凋亡发生率，并以细胞总数的百分比表示。

1.2.4 Western blot试验：

GECs用RIPA裂解缓冲液裂解，BCA测定试剂盒测定蛋白质浓度。在裂解液中加入1/5体积的loading-buffer, 然后将样品置于沸水中10 min。蛋白质通过硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)术分离并转移到PVDF膜上。PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭1 h, 然后与一抗抗体在4 ℃孵育过夜。一抗抗体包括Piezo 1(1∶500)和Gapdh(1∶5 000)。PVDF膜经TBST洗涤后，与含有二抗抗体的稀释液共孵育1 h。二抗抗体含有山羊抗小鼠IgG (H+L) HRP(1∶10 000)或山羊抗兔IgG(H+L) HRP(1∶10 000)。通过超敏ECL化学发光试剂盒和ChemiDoc成像系统检测目的蛋白，并用ImageJ软件分析。

1.2.5 Ca2+指示剂检测：

用Cal-590 AM测定细胞内钙浓度。在25 μm的共聚焦激光皿中接种GECs, 然后在含有0.02% Pluronic F-127和1 mmol/L Probenecid的Hank′s平衡盐溶液中加入5 μmol/L Cal-590 AM,在37 ℃黑暗中孵育1 h。然后用HBSS洗涤GECs 3次。通过激光共聚焦Ca2+成像技术确定钙内流，以评估GECs的细胞内钙动态。Hoechst 33258用于细胞核染色。

1.2.6 免疫荧光染色：

GECs在4%多聚甲醛中固定30 min。在免疫染色穿透液中孵育后，GECs与一抗抗体Piezo 1(1∶100)在4 ℃下孵育过夜。PBS洗涤3次后，取山羊抗兔IgG(H+L) Dylight 488荧光标记二抗(1∶500)在黑暗中孵育1 h。Hoechst 33258用于细胞核染色。激光共聚焦显微镜用于采集图像。

1.2.7 激活剂Yoda

1与抑制剂GsMtx 4:Piezo 1特异性激动剂Yoda1溶解在DMSO中，浓度为1 μmol/L,用于模拟Piezo 1的激活作用。Piezo 1抑制剂GsMTx 4溶解在DMSO中，浓度为0.5 μmol/L,处理细胞，实现对Piezo 1的化学抑制。以DMSO单独处理的GECs为对照组。

1.2.8 Lv-shPiezo 1的构建：

由上海宣尊生物科技有限公司构建了Piezo 1 shRNA慢病毒表达载体(pLVX-shRNA-Puro-Piezo 1, Lv-shPiezo 1)及其对照慢病毒载体(pLVX-shRNA-Puro, Lv-Ctrl)。Piezo 1 shRNA靶序列为5′-GGAGTATGCCAACGAGAAGCA-3′。用Lv-shPiezo 1或Lv-Ctrl分别感染GECs 24 h, 复感染指数(multiplicity of infection, MOI)为20。

1.3 统计学分析

数据统计采用SPSS 22.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差

表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 流体剪切力诱导了GECs凋亡

相较于对照组，其余4组GECs的调亡率均升高，且随着细胞形变量增大，即机械刺激越强，凋亡率也逐渐升高(P<0.05)(图1)。10%的形变量组可以引起GECs中等凋亡，后续实验中采取10%形变量。

图1 流式细胞测量术检测各组GECs凋亡率

2.2 Piezo 1在GECs细胞中普遍表达，剪切力可以激活Piezo 1通道蛋白

免疫荧光染色显示Piezo 1在GECs的细胞内普遍表达(图2A)。与对照组相比，剪切力组GECs的Ca2+内流增加，表明Piezo 1通道蛋白被激活(图2B)。且与对照组相比，剪切力组GECs的Piezo1蛋白表达含量增高(P<0.05)(图2C)。

图2 GECs中Piezo 1表达和激活情况

2.3 Yoda1促进GECs凋亡，GsMtx 4抑制GECs凋亡

分别用1 μmol/L Yoda1及0.5 μmol/L GsMtx 4处理GECs后，观察GECs凋亡情况，结果显示，相较于对照组，Yoda 1组凋亡率增高(P<0.05);相较于剪切力组，剪切力+GsMtx 4组凋亡率减低(P<0.05)(图3)。

图3 Yoda 1及GsMtx 4处理下GECs的凋亡率

2.4 Lv-shPiezo 1可以敲低Piezo 1表达，敲低后剪切力诱导GECs凋亡降低

使用慢病毒Lv-shPiezo 1转染GECs后，通过Western blot验证Lv-shPiezo 1敲低效率，结果显示，Lv-shPiezo 1组GECs中Piezo 1表达降低(图4)。利用流式细胞仪检测转染慢病毒后剪切力下GECs的凋亡情况，结果显示，对照组GECs的凋亡率为7.84%±0.46%,Yoda 1组GECs的凋亡率为17.02%±0.22%, 剪切力组GECs的凋亡率为17.42%±0.53%,剪切力+GsMtx 4组GECs的凋亡率为11.91%±0.21%。相较于对照组，剪切力组、剪切力+Lv-Ctrl组细胞凋亡率增高(P<0.05);相较于剪切力组、剪切力+Lv-Ctrl组，剪切力+Lv-shPiezo 1组细胞凋亡率降低(P<0.05)(图5)。

图4 Western blot检测Piezo 1蛋白表达

图5 慢病毒处理下GECs的凋亡率

3、讨论

高血压肾损害的基本发病机制是血流动力学改变导致肾小球硬化、肾小管萎缩和肾间质纤维化[9]。原发性高血压会引起肾小球内流体剪切力升高，引发内皮细胞肿胀、纤维蛋白样坏死、毛细血管或小动脉血栓。GECs是构成肾小球滤过屏障的关键，对肾小球的功能至关重要，而GECs凋亡导致肾小球的损伤是高血压肾损害发展的重要病理过程[10]。有研究表明在高血压肾损害发生过程中，灌注压长期上升与GECs凋亡密切相关[4]。也有研究表明， GECs的凋亡与血管内剪切力升高有关，与本研究的结论有一致性[11]。本研究发现流体剪切力促进GECs的凋亡，且随着剪切力增强，GECs凋亡增加，这也部分解释了高血压引发肾小球损伤的原因。

Piezo 1蛋白是一种机械力敏感通道蛋白，可将宏观机械信号转化为细胞内生物信号，是非神经细胞感受刺激的重要途径[12]。Piezo 1的结构类似于三叶螺旋桨的结构，在机械刺激下从闭合状态变为开放状态，从而允许阳离子流入胞质，特别是 Ca2+。已有研究表明参与机械刺激诱导的软骨细胞、Ⅱ型肺泡细胞和肿瘤细胞等多种细胞的凋亡[8,13]。也有研究表明异常流体剪切力下的胶质瘤细胞内Piezo 1的表达和活化增加，从而允许大量 Ca2+流入导致细胞凋亡[14]。因此，探究流体剪切力下Piezo 1与GECs凋亡间关系对高血压肾损害的机制探索有着重要意义。

本研究通过Flexcell拉力仪模拟不同强度的流体剪切力，进而观察流体剪切力与GECs凋亡之间的关系，并发现了流体剪切力确实促进了GECs的凋亡。接着通过免疫荧光试验证了Piezo 1在GECs中广泛表达，且通过Ca2+指示剂证实了流体剪切力可以促进Piezo 1通道的激活，且Western blot试验表明剪切力促进了Piezo 1的表达。随后使用激活剂Yoda 1、抑制剂GsMtx 4及Lv-shPiezo 1处理GECs, 并发现激活Piezo 1蛋白促进GECs凋亡，而抑制Piezo 1蛋白可以缓解GECs的凋亡。

综上所述，本研究证实了流体剪切力可以通过激活Piezo 1蛋白并增强其表达诱导GECs凋亡，从而促进高血压肾损害的发生；而抑制Piezo 1可减轻GECs凋亡，Piezo 1可能会成为治疗高血压肾损害的重要靶点。

参考文献:

[12]郭雨松.机械感受器Piezo离子通道激活与调控机制[J].自然杂志,2022,44:182-194.

基金资助:青海省卫生健康委员会重点课题(2022-wjzd-02);

文章来源:罗梦琳,郑峰,季欣瑶,等.流体剪切力通过激活Piezo 1蛋白促进肾小球内皮细胞凋亡[J].基础医学与临床,2024,44(09):1236-1242.