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牛磺熊去氧胆酸减轻重症急性胰腺炎诱导的模型大鼠肝损伤

2024-09-03 117 上传者：管理员

摘要：目的探讨牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）经蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）通路对重症急性胰腺炎（SAP）大鼠肝损伤的作用及机制。方法将30只SD大鼠随机分为3组（每组10只）:假手术组（SO组）、重症急性胰腺炎组（SAP组）和牛磺熊去氧胆酸组（TUDCA组）。通过逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠（STC）溶液（1 mL/kg）建立SAP大鼠模型。造模前，TUDCA组大鼠连续3 d经腹腔注射TUDCA溶液(400 mg/kg·d-1),SAP组和SO组大鼠经腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液。造模后12 h处死大鼠，采集静脉血及部分胰腺及肝组织，使用全自动生化仪检测淀粉酶（AMY）、谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）水平；酶联免疫吸附检测试剂盒（ELISA）检测白细胞介素-6（IL-6）的表达；苏木精-伊红（HE）染色观察胰腺及肝脏组织病理学的变化；原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法（TUNEL）观察肝细胞凋亡情况；Western blot测定肝脏组织大鼠葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、C/EBP同源蛋白（CHOP）、核因子-κB p65（NF-κB p65）和半胱天冬酶-3（caspase-3）蛋白的表达。结果与SO组比较，SAP组大鼠血清AMY、AST、ALT及IL-6表达上升（P<0.05）;胰腺和肝脏组织坏死及肝细胞凋亡程度增加；肝脏GRP78、PERK、CHOP、NF-κB p65及caspase-3蛋白水平升高（P<0.05）。与SAP组比较，TUDCA组大鼠血清AMY、AST、ALT及IL-6表达下降（P<0.05）;胰腺和肝脏组织坏死及肝细胞凋亡程度降低；肝脏GRP78、PERK、CHOP、NF-κB p65和caspase-3蛋白水平降低（P<0.05）。结论 TUDCA可能通过抑制PERK信号通路，减少内质网应激（ERS）的发生，减轻炎性反应及细胞凋亡，对重症急性胰腺炎诱导的大鼠肝损伤起保护作用。

关键词：
SAP
内质网应激
急腹症
牛磺熊去氧胆酸
重症急性胰腺炎
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重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是临床常见的急腹症，起病急骤、病情凶险，易诱发全身性炎性反应，甚至导致多器官功能障碍综合征，病死率高达15%～30%[1]。肝脏是SAP累及的主要胰外器官之一，而肝脏受损通过影响毒素代谢、释放炎性反应介质等途径进一步加剧SAP的发展，最终导致病死率上升[2]。目前虽已证实内毒素血症、微循环障碍、肝细胞凋亡、细胞因子与炎性反应介质等在SAP并发肝损伤中起到重要作用[3],但具体机制仍未完全清楚。

内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是指在缺氧、钙离子失调和感染等刺激因素导致内质网功能障碍，内质网调节蛋白质合成及折叠蛋白质能力下降，出现错误折叠和未折叠蛋白质积聚的状态，在缺血/再灌注损伤和脓毒症等疾病发展过程中发挥着重要作用[4]。肝细胞内存在大量的内质网，许多肝脏相关疾病已证实与ERS有关，如酒精性脂肪肝病、肝炎的病毒复制及肝癌的发生等[5-6]。蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)信号通路是ERS的经典通路之一，业已证实，糖尿病、神经退行性病变和肿瘤等疾病已证实与PERK通路密切相关[7-8],其在SAP合并肝损伤时的作用及机制，尚缺乏深入的研究。牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid, TUDCA)是由牛磺酸与熊去氧胆酸结合形成的一种内质网应激抑制剂，可通过抑制内质网应激，提高内质网重折叠和降解错误蛋白质的能力，减少损伤。本研究旨在建立SAP大鼠肝损伤模型的基础上，探讨TUDCA经PERK通路对SAP大鼠肝损伤的作用及可能的机制。

1、材料及方法

1.1 材料

1.1.1 动物：

成年雄性SPF级SD大鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司),实验前适应性喂养 3 d。本研究已获武汉科技大学附属孝感市中心医院实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 试剂及试剂盒：

大鼠葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、C/EBP 同源蛋白(C/Ebp-homologous protein, CHOP)、抗核因子-κB p65(NF-κB p65)抗体及半胱天冬酶-3(caspase-3)抗体(Cell Signaling Technology公司)。原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)试剂盒(Roche公司)。大鼠白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫吸附检测试剂盒(上海科艾博生物技术有限公司)。牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid, TUDCA)及牛磺胆酸钠(sodium taurocholate, STC)(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型建立：

将30只大鼠随机分为假手术组(SO组)、SAP组和TUDCA组，每组10只。TUDCA组大鼠在SAP造模前连续3 d经腹腔注射400 mg/kg TUDCA溶液，SO组与SAP组大鼠在腹腔内注射同等剂量的0.9%氯化钠溶液。参照参考文献[9]构建SAP大鼠肝损伤模型，通过异氟烷气体麻醉大鼠后，取上腹部正中切口入腹，SAP组和TUDCA组大鼠釆用微量泵、经胆胰管逆行匀速注射5% STC溶液；SO组打开腹腔后仅翻动胰腺，不注射STC溶液。SAP大鼠肝损伤模型建立成功后12 h处死3组大鼠，开腹后分布采集大鼠静脉血3 mL,经离心后取上层血清，分装后冻存；取部分胰腺及肝脏组织，经4%多聚甲醛溶液固定，予以石蜡包埋后切片待检测。

1.2.2 生化指标检测：

取大鼠静脉血清，采用全自动生化仪检测淀粉酶(amylase, AMY)、谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase, GOT/AST)及谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase, GPT/ALT)水平。

1.2.3 酶联免疫吸附剂试验(ELISA)检测IL-6的表达：

通过下腔静脉取血，离心(4 000 r/min, 15 min),取上层血清，严格按照ELISA说明书，检测血清中IL-6的表达水平。

1.2.4 苏木精-伊红(HE)染色法观察胰腺及肝脏组织病理学变化：

将胰腺及肝脏组织洗净，剪成均匀小块，先置于4%多聚甲醛中固定12 h, 经脱水后石蜡包埋、切片(4 μm～5 μm)、脱蜡、水化、染色(约5 min)后封片，显微镜下观察胰腺及肝脏组织的病理学变化。

1.2.5 TUNEL检测肝细胞凋亡：

取已制备的肝组织石蜡切片，进行脱蜡水化处理，经稀释液孵育后，加入TUNEL工作液中，严格按试剂盒说明进行检测。染色完成后封片，用光学显微镜观察细胞的凋亡。

1.2.6 Western blot检测GRP78、PERK、CHOP、NF-κB p65和caspase-3:

取适量肝组织，加入裂解液匀浆，提取肝组织总蛋白质，采用BCA法定量后分装。根据浓度取适量蛋白质，经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移至硝酸纤维素(PVDF)膜，经脱脂奶粉溶液封闭，加入一抗溶液(稀释浓度为1∶1 000),经4 ℃冰箱孵育过夜。次日经洗膜液清洗3次后加入二抗(稀释浓度为1∶10 000)室温孵育1 h, 洗膜液清洗3次后化学发光试剂(ECL)显影，曝光扫描。采用Odyssey infrared imaging system软件对样本的蛋白质表达进行分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差

表示，经正态性检验后组间的差异采用方差分析。

2、结果

2.1 大鼠血清AMY、AST、ALT及炎性反应因子IL-6的表达

各组大鼠血清AMY、AST、ALT及炎性反应因子IL-6的检测结果见表1。与SO组比较，SAP组大鼠AMY、AST、ALT及炎性反应因子IL-6的表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与SAP组比较，TUDCA组大鼠AMY、AST、ALT及炎性反应因子IL-6表达水平下降(P<0.05)(表1)。

AMY.amylase; GOT/AST.glutamic oxaloacetic transaminase; GPT/ALT.glutamic-pyruvic transaminase;*P<0.05 compared with SO group;#P<0.05 compared with SAP group.

表1 各组大鼠血清指标比较

2.2 HE染色观察大鼠胰腺病理变化

SO组大鼠胰腺组织结构完整，无充血、水肿及坏死，可见少许炎性细胞浸润；SAP组大鼠胰腺组织结构被破坏、腺泡大量坏死；小叶间隔可见大量炎性细胞及红细胞；TUDCA组大鼠胰腺组织结构排列、细胞坏死程度及炎性细胞浸润程度较SAP组减轻(图1)。

图1 TUDCA减轻SAP诱导的大鼠胰腺组织的病理学损伤

2.2 HE染色观察大鼠肝脏病理变化

SO组大鼠肝脏组织结构清楚，细胞排列整齐，少许红细胞及炎性细胞渗出；SAP组肝脏组织结构紊乱，肝窦扩张，肝细胞水肿、部分坏死，周围大量炎性细胞浸润；TUDCA组大鼠肝脏组织结构排列、细胞水肿、坏死程度及炎性细胞浸润程度较SAP组减轻(图2)。

图2 TUDCA减轻SAP诱导的大鼠肝脏组织的病理学损伤

2.3 TUNEL法检测大鼠肝脏细胞凋亡

TUNEL染色下凋亡细胞呈圆形，细胞核染色质聚集成团块状，呈棕黄色。SO组凋亡细胞较少，正常肝细胞占多数；与SO组相比较，SAP组细胞凋亡明显增多；与SAP组相比较，TUDCA组细胞凋亡明显减少(图3)。

图3 各组大鼠肝脏细胞凋亡改变

2.4 大鼠肝脏组织GRP78、PERK、CHOP、NF-κB p65和caspase-3蛋白的表达

与SO组比较，SAP组大鼠肝组织GRP78、PERK、CHOP、NF-κB p65和caspase-3蛋白表达增加(P<0.05)。与SAP组比较，TUDCA组大鼠肝组织GRP78、PERK、CHOP、NF-κB p65和caspase-3蛋白表达降低(P<0.05)(图4～6)。

图4 各组大鼠肝脏组织GRP78的蛋白表达

图5 各组大鼠肝脏组织PERK与NF-κB p65的蛋白表达

图6 各组大鼠肝脏组织PERK、CHOP和caspase-3蛋白表达

3、讨论

SAP动物肝损伤发生率高，探讨其机制有助于降低发生率，减轻损伤，改善预后。本实验血清检测结果显示，SAP组大鼠AMY、AST和ALT显著升高，HE染色显示胰腺及肝组织结构明显破坏及大量炎性细胞浸润，提示SAP组大鼠模型创建成功，且肝损伤程度严重；而TUDCA组与SAP组大鼠相比较，AST和ALT降低，肝脏组织结构损伤及炎性细胞浸润程度减轻，提示TUDCA可减轻SAP大鼠肝脏的损伤。

GRP78通过改变蛋白质的折叠状态及调节转运，促进内质网结构恢复，是ERS保护机制中的关键性调控分子，也是ERS发生的标志蛋白[10]。本实验Western blot结果显示，SAP组大鼠肝组织GRP78蛋白表达较SO组明显升高，提示SAP组大鼠的肝内大量组织发生了ERS;而TUDCA组GRP78蛋白表达较SAP组降低，提示TUDCA的干预能有效的减少SAP大鼠肝组织内ERS的发生。

PERK信号通路可通过调控NF-κB蛋白表达，促进其启动促炎因子基因转录，释放多种炎性反应介质及细胞因子[11]。IL-6是体内具有多种功效的细胞因子，主要参与炎性反应、免疫调节、肿瘤形成等过程[12]。本实验ELISA及Western blot结果提示，SAP组大鼠血清IL-6及肝组织NF-κB p65蛋白表达较SO组升高，而TUDCA组大鼠血清IL-6及肝组织NF-κB p65蛋白表达较SAP组下降，提示SAP刺激肝组织发生ERS时，可通过激活PEKR通路，促进NF-κB的活化，促进IL-6释放，加重肝组织的炎症反应；而TUDCA可以通过抑制肝组织内ERS的发生，阻断PEKR通路，抑制NF-κB的活性，减少IL-6释放，从而减轻炎性反应。

ERS发生时，通过激活PERK,诱导其下游CHOP的表达，最终活化caspase-3,经线粒体途径引起细胞凋亡[13]。本实验中TUNEL结果提示SAP组大鼠肝细胞凋亡程度较SO组升高，而TUDCA组大鼠肝细胞凋亡程度较SAP 组下降；Western blot结果显示，与SO组比较，SAP组大鼠肝细胞中PERK、CHOP和caspase-3蛋白表达升高；与SAP组比较，TUDCA组大鼠肝细胞中PERK、CHOP和caspase-3蛋白表达下降，提示SAP组大鼠通过激活PERK-CHOP通路，促进细胞凋亡；而TUDCA可通过阻断PERK-CHOP通路，减少细胞凋亡。

本实验结果表明，TUDCA可能通过阻断PERK信号通路，减轻炎性反应，减少肝细胞凋亡，从而对重症急性胰腺炎大鼠肝损伤起保护作用，具体的机制仍需进一步研究。

参考文献:

[3]刘玉兰,王洋.重症急性胰腺炎致肝损伤的诊断和治疗[J].中华消化杂志,2019,39:292-294.

[6]李明皓,范亮亮,项荣.内质网应激在丙肝病毒感染发病学中作用的研究进展[J].基础医学与临床,2022,42:316-320.

基金资助:孝感市自然科学基金(XGKJ2022010012);

文章来源:殷强,汪磊,李童浩.牛磺熊去氧胆酸减轻重症急性胰腺炎诱导的模型大鼠肝损伤[J].基础医学与临床,2024,44(09):1249-1255.