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miR-322对高原肺动脉高压发生发展的影响及作用机制
摘要：目的 探讨miR-322对高原肺动脉高压发生发展的影响及作用机制。方法 SPF级雄性SD大鼠40只,随机数字表法分为4组(n=10),即常氧组、低氧组、空白病毒+低氧组(空载体组),miR-322抑制+低氧组(miR-322沉默组),剔除实验过程中死亡大鼠后常氧组10只,低氧组、空载体组、miR-322沉默组各9只。测定肺动脉氧分压[p(O2)]和平均肺动脉压(mPAP);HE染色观察肺组织变化；免疫荧光观察组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化；实时荧光定量PCR检测大鼠肺组织中miR-322和apelin mRNA基因表达；Western blot法检测大鼠肺组织中apelin蛋白的表达。结果 低氧组和空载体组肺动脉p(O2)、mPAP和肺组织各项指标差异均无统计学意义。与常氧组比较,低氧组mPAP、α-SMA、apelin mRNA和蛋白以及miR-322 mRNA相对表达量均升高,p(O2)下降(P<0.05)；肺组织破坏严重,大量炎症细胞浸润。与低氧组比较,miR-322沉默组mPAP和miR-322 mRNA相对表达量均下降,α-SMA、p(O2)以及apelin mRNA和蛋白相对表达量上升(P<0.05)；肺组织损伤程度降低。结论 抑制miR-322表达可促进高原肺动脉高压模型大鼠apelin的表达,进而降低高原肺动脉高压的上升程度。
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由于高原低压、低氧环境的影响，长期居住或急进高原人群常常会有不同程度的高原肺动脉高压（high altitude pulmonary hypertension,HAPH）。高原肺水肿与HAPH联系密切，高原肺水肿是HAPH、肺泡液累积等因素综合作用的结果。研究认为，HAPH是导致高原肺水肿发病的关键因素，是目前常见的一种治疗不及时可致高病死率的呼吸系统疾病，因此深入了解和探究高原病发病机制，对高原病的防治具有重要意义[1]。HAPH与心血管舒张有密切联系。研究发现，apelin可通过舒张血管来降低肺动脉高压上升程度以缓解HAPH[2]。HAPH在低压低氧条件下可诱导缺氧诱导因子-1α等因子上调[3]，其中miR-322表达上调明显，说明其在HAPH形成中有重要的作用[4]。miRNA是一类高度保守的非编码RNA，可以抑制mRNA的翻译功能或使其降解[5]。本实验拟使用SD大鼠建立缺氧性肺动脉高压模型，通过腺相关病毒转染封闭miR-322相关序列实现差异性表达，以期阐述miR-322对apelin的影响及调控肺动脉高压的机制。
1、材料与方法
1.1实验动物与试剂
SPF级雄性SD大鼠40只，8周龄，体质量180～200 g，购自军事医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK-（军）2012-0004。大鼠饲养于清洁、通风良好环境，自由摄食、饮水。总RNA提取试剂盒、miRNA提取试剂盒（中国福际公司），逆转录试剂盒（K1622）和apelin抗体（abcam公司），α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（boster公司），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗、Alexa 488标记山羊抗小鼠IgG二抗（servicebio公司），Quantscript RTKit和Real Master Mix(Probe）购自天根生化科技有限公司。空载腺病毒以及miR-322-5P封闭腺病毒由和元生物技术（上海）股份有限公司合成。TaqMan探针及引物委托中美泰和公司完成。
1.2方法
1.2.1HAPH动物模型建立
40只大鼠以随机数字表法分为常氧组、低氧组、空载体组及miR-322沉默组（n=10），剔除实验过程中死亡大鼠后常氧组10只，低氧组、空载体组、miR-322沉默组各9只。病毒转染采用气道转染法[6]，转染完成后与低氧组相同方法造模。低压氧舱模拟6 000 m海拔高度，舱内大气压47.5 kPa,9.5%～10.1%O2连续低氧培养21 d，制备低氧性肺动脉高压大鼠模型[7]，常规饲料喂养；常氧组自由呼吸进食，其他条件相同。
1.2.2大鼠处理与取材
大鼠饲养21 d后，造模大鼠从低压氧舱中快速取出，与常氧组大鼠均采用异氟烷吸入法麻醉，右心漂浮导管法检测肺动脉压，计算各组大鼠平均肺动脉压（m PAP）并取颈动脉血0.5 mL进行肺动脉氧分压[p(O2）]检测；放血处死各组大鼠，随机数字表法抽取每组大鼠5只，取肺组织约100 mg提取总蛋白用于Western blot检测，20 mg提取总RNA,30 mg提取miRNA用于PCR检测。
1.2.3HE染色观察肺组织形态
肺组织置于10%福尔马林中固定，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、HE染色后在光镜下（×200）观察肺组织学形态，每张切片随机读取3个视野。
1.2.4免疫荧光染色观察α-SMA表达
石蜡切片经二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，抗原修复，山羊血清封闭，加入α-SMA一抗，4℃过夜，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline,PBS）避光洗涤后孵育二抗，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下（×400）观察。
1.2.5实时荧光定量PCR(qPCR）法检测肺组织miR-322以及apelin m RNA表达
严格按照试剂使用说明书提取总RNA及miRNA，用TaqMAN探针法进行qPCR扩增，每个样本做3个复孔。以10倍稀释模板样本进行PCR反应，反应条件：50℃预变性2 min,95℃预变性10 min;95℃变性15 s,60℃退火延伸1 min，共40个循环，以内参照基因（GAPDH）进行相对定量，采用2-ΔΔCt法对结果进行分析，计算miR-322和apelin mRNA表达水平。qPCR引物见表1。
表1 qPCR引物序列
1.2.6Western blot法检测肺组织apelin蛋白表达
取约100 mg肺组织，加入RIPA裂解液1 m L，冰上研磨制备成匀浆。4℃离心10 min，留取上清液并用BCA法进行蛋白定量。每组取45μg，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（80 V,100 min）分离后进行转膜、封闭，经封闭后加入apelin一抗（1∶500)4℃过夜，次日PBST（含1%吐温-20的磷酸盐缓冲液，PBS-Tween-20）漂洗3次，每次10 min；加入二抗（1∶5 000），室温摇床1 h后，PBST漂洗3次，每次10 min，加入ECL化学发光剂曝光显影。以目的蛋白与内参GAPDH的灰度值比值代表目的蛋白的相对表达量。
1.3统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件包进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法。P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1大鼠p(O2）与mPAP比较
与常氧组比较，低氧组、空载体组及miR-322沉默组p(O2）均下降，mPAP均升高；与低氧组比较，miR-322沉默组p(O2）上升，mPAP下降（P<0.05），低氧组和空载体组2指标差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
表2各组大鼠肺动脉氧分压和平均肺动脉压比较
2.2各组肺组织形态学变化
常氧组肺泡间隔正常，组织结构良好。与常氧组比较，低氧组肺泡间隔明显增宽，肺泡及肺间隔可见红细胞，肺泡腔中出现大量炎症细胞，损伤严重，空载组与低氧组损伤程度相似。miR-322沉默组较低氧组损伤程度降低，见图1。
图1各组大鼠肺动脉形态学变化
2.3大鼠肺组织α-SMA表达
常氧组肺组织中α-SMA表达量较低，低氧组较常氧组表达上升，miR-322沉默组较低氧组表达量进一步上升，见图2。
2.4各组肺组织miR-322和apelin蛋白及mRNA的表达水平比较
与常氧组比较，低氧组、空载体组及miR-322沉默组miR-322 mRNA相对表达量、apelin mRNA和apelin蛋白相对表达量升高；与低氧组比较，miR-322沉默组miR-322 mRNA相对表达量降低，apelin mRNA和蛋白相对表达量升高（P<0.05）；低氧组与空载体组各指标差异均无统计学意义（P>0.05），见表3、图3。
表3各组miR-322以及apelin蛋白和m RNA相对表达水
图3各组肺组织中apelin蛋白表达情况
3、讨论
急进高原地区的人群由于高原低压和低氧环境的影响，常引起急性高原病。急性高原病以低氧性肺动脉高压引起的急性高原肺水肿最为典型，该病起病急、病情重，救治不及时可造成病死率明显增高。急性高原肺水肿发病机制复杂，体内调控基因及影响因子多，发病机制尚不明确[8,9]。目前，关于高原型肺动脉高压研究发现，apelin可在低氧或缺氧条件下扩张心血管以减轻肺动脉压上升程度[10,11]，但大多是在蛋白水平上的研究和探讨，近几年关注于基因水平上探究肺动脉高压的调控机制。miRNA不同基因在不同程度上参与了肺动脉高压的调节[12]。不同的肺动脉高压模型引起的miRNA表达效果有差异，多种miRNA如miR-145/143、miR-23b等[13,14]均可影响肺动脉高压的调节，导致肺动脉重塑。但是在高原肺动脉高压发病过程中apelin的调控机制仍不清楚。
本实验中21 d的低压低氧干预使大鼠形成了典型的肺动脉高压，与以往实验研究中的大鼠肺动脉高压的结果一致[7]。本研究结果显示，与常氧组比较，低氧组mPAP、α-SMA、apelin蛋白以及miR-322mRNA相对表达量均升高，p(O2）下降，肺组织破坏严重，可见大量炎症细胞浸润。与低氧组相比，miR-322沉默组mPAP以及miR-322 mRNA相对表达量均下降，α-SMA、p(O2）、apelin蛋白相对表达量上升，miR-322沉默组肺组织损伤程度减轻，表明miR-322 mRNA可通过抑制apelin的表达，从而使肺动脉压上升，在miR-322被抑制后，apelin表达上升，降低了肺动脉压上升程度，同时减轻了肺组织的损伤，提示在高原型肺动脉高压中，miR-322低表达可以上调apelin蛋白的表达，这与Zhu等[10,11]研究结果一致。HE染色结果显示，低氧组肺组织损伤严重，而miR-322沉默组中肺组织损伤明显减轻；免疫荧光结果表明，apelin高表达可以促进α-SMA表达，增加血管扩张程度，缓解肺动脉压的上升并且降低血管增厚程度，这与HE结果一致，再次证实miR-322抑制了apelin的表达，内源性apelin可以舒张血管，增加平滑肌活跃性，这一点不同于吴媛媛等[15]外源性apelin作用效果结论，该研究认为在临床上要尽可能避免使用外源性apelin治疗高原肺动脉高压。
综上，大鼠高原型肺动脉高压模型大鼠肺组织中miR-322和apelin表达明显升高，在抑制miR-322后，apelin表达进一步升高，miR-322可能通过降低肺组织内源性apelin蛋白的表达，降低了机体的血管扩张反应，不利于机体适应高原性气候的生活。
图2各组大鼠肺组织α-SMA表达情况
参考文献：
[6]金强,甄玉文,周南,等.腺病毒介导的eNOS基因转移对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的影响[J].临床军医杂志,2015,43(10):998-1001.
[9]凡小庆,王瑞婷,柴小青,等.先天性心脏病合并肺动脉高压患者围术期IL-17水平的变化[J].天津医药,2017,45(10):1036-1039.
[14]吴松林,田小利,徐陶,等.microRNA-125b在脓毒症急性肺损伤中的表达及其与炎症因子水平相关性[J].天津医药,2019,47(8):810-814.
[15]吴媛媛,孙秀珍,刘昀,等.Apelin抑制小鼠气道平滑肌细胞增殖的作用及机制[J].实用医学杂志,2019,35(2):177-180.
张凤涛,李晓红,王景景,孙洪涛,陈翀,陈锋.miR-322对大鼠高原性肺动脉高压的作用及机制研究[J].天津医药,2020,48(07):621-624+690.
基金:国家自然科学基金资助项目(81772018､81971782)
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