1,5-脱水葡萄糖醇(1,5-anhydroglucitol,1,5-AG)与葡萄糖的化学结构相似，为六碳糖醇，具有吡喃环结构，由葡萄糖吡喃环状结构中1位上脱氧形成[1]。人体内1,5-AG主要来源于饮食[2]，在肠道中被吸收，并分布到各种器官和组织中[3]。在健康状态下，各组织间1,5-AG浓度水平相对稳定[4]。当发生糖尿病，血糖高于肾阈值时，会竞争性的抑制1,5-AG在肾近曲小管的重吸收，导致尿中1,5-AG排泄增加，血清中含量降低[5]。2003年，1,5-AG被美国食品药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准作为短期血糖监测的指标[6]。临床上常用于监控血糖水平波动的指标还有糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin,Hb A1C)、糖化白蛋白(glycatedalbumin,GA)和果糖胺(fructosamine,FA)等。HbA1C反映近3个月内血糖的平均水平[7],GA和FA可评估2～3周内血糖控制情况[8,9]，而1,5-AG则可反映1～2周内更短时间的血糖变化[2]。此外，据文献报道，1,5-AG在反映餐后高血糖和血糖波动方面也具有一定的优势[7]。

目前广泛应用的血清1,5-AG的定量方法主要为FDA推荐的GlycomarkTM试剂盒方法[10]。其原理首先用已糖激酶将干扰定量的葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，再将1,5-AG在吡喃糖氧化酶的作用下生成1,5-脱水果糖和过氧化氢，继而在辣根过氧化酶的催化下生成比色产物，引起在特定波长下的吸光度升高[11]。该方法灵敏且精确，但必须去除血清中葡萄糖等类似物的干扰，才能特异性定量1,5-AG的含量。此外，早些年也有用气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)定量血清1,5-AG[12]，该方法首先需要去除样本中的蛋白，再将去蛋白后的提取液浓缩干燥，加入硅烷化试剂进行衍生。在特定的升温程序下，根据化合物沸点的不同，分离目标化合物，结合外标法定量1,5-AG。此方法前处理较为复杂[13]。作者开发了一种利用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(ultra-performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry,UPLC-TQMS)定量血清1,5-AG的方法，样本前处理简单，不受血清中葡萄糖等干扰物质的影响，检测时间较短，可为临床批量样本的筛查提供一种简便、快捷的方法。

1、材料与方法

1.1仪器

UPLC-TQMS(型号:XEVO-TQ，美国Waters公司)，色谱柱ACQUITY UPLCBEH Amide(2.1×100 mm,1.7μm粒径)，预柱VanGuardTMPrecolumn ACQUITY UPLCBEH Amide(2.1×5 mm,1.7μm粒径)都选自美国Waters公司，EXP电子分析天平(瑞士Mettler Toledo仪器公司)，Milli-Q超纯水系统(美国Millipore仪器公司)。

1.2试剂

1,5-脱水-D-葡萄糖醇标准品(纯度≥98%)购自美国Sigma-Aldrich公司，内标(internal standard,IS)1,5-脱水-D-13C葡萄糖醇(1,5-anhydroD-13C6-glucitol,13C6-1,5-AG，纯度≥98%)购自美国Omicron Biochemicals公司。氨水购于美国SigmaAldrich公司，MS级别的乙腈和甲醇均购于美国Fisher Chemical公司。超纯水由Milli-Q系统纯化，!=18.2。

1.3研究对象

从上海交通大学附属第六人民医院内分泌科门诊收集经口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)即口服75 g葡萄糖液体后，监测血糖变化。根据WHO标准诊断为健康正常对照10例，糖尿病前期8例和糖尿病22例的空腹和2 h的静脉血静置2 h后，于1 200 r/min下离心20 min，取血浆-80℃保存，待用。样本的临床指标见表1。

表1健康对照与糖尿病人的临床指标

1.4方法

1.4.1样本前处理方法

称取1 mg同位素内标13C6-1,5-AG溶于1 m L甲醇中配制浓度为1 mg/m L的13C6-1,5-AG，取200μL同位素内标母液加入含800 m L乙腈和200 m L甲醇的溶液中配制成提取溶剂。于50"L的血浆中加入300μL-20℃预冷过的提取液(含200 ng/m L13C6-1,5-AG)，涡旋30 s，使样本与提取液充分混合，放置-20℃冰箱20 min后，于4℃、13 500 r/min离心10 min，取上清到进样瓶中待检测。

1.4.2色谱条件

柱温45℃，进样体积5μL，流速0.5 m L/min。流动相A由乙腈∶异丙醇∶水(95∶5∶5,v∶v∶v)+0.05%氨水组成，相B由水+0.05%氨水组成。梯度洗脱程序见表2。

表2梯度洗脱程序

1.4.3质谱条件

采用负离子多重反应监测模式，电喷雾离子源。离子源温度150℃，毛细管电压2.0 k V，脱溶剂气温度500℃，脱溶剂气流速1 000L/h，锥孔流速50 L/h。1,5-AG及13C6-1,5-AG的定量离子见表3。

表3 1,5-AG和13C6-1,5-AG的定量离子

1.4.4提取溶剂的选择

为了有效地提取血清中的1,5-AG，本研究摸索了乙腈与甲醇在1∶0、8∶2、1∶1、2∶8、0∶1不同比例下的提取效果。采用所有测试样本等量混合作为方法学考察所用样本(quality control,QC)。平行取5份QC样本，每份50μL，分别加入以上预冷过的不同比例的提取溶剂300μL，涡旋30 s,-20℃下放置20 min后，于4℃下，13 500 r/min离心10 min，取上清液进样。比较不同比例溶剂组合下1,5-AG的峰型及响应强度，确定最佳提取溶剂。

1.4.5检测限、定量限和线性

将1,5-AG的标准品储存液用水稀释为一系列浓度的标准溶液，以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)对应的浓度分别为检测限(limits of detection,LOD)和定量限(limits of quantitation,LOQ)。在确定LOQ后，用1、2、4、8、10、15、20、25、40μg/m L的标准溶液，由低到高的顺序进样，以标准液的浓度(μg/m L)为横坐标，定量离子对的峰面积为纵坐标，建立线性回归方程，考察其线性。

1.4.6重复性

分别取6份低(2μg/m L)、中(10μg/m L)、高(25μg/m L)的标准品溶液和6份QC样本，以确定好的提取溶剂比例，平行提取样本，取上清液进样测定。比较6针1,5-AG的峰面积，计算峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.4.7日内精密度与日间精密度

取3等份QC样本，1 d内处理1个QC样本，重复进样6次，计算6针所得的1,5-AG峰面积的RSD，考察日内精密度。3 d内每天处理1个QC样本，每天的样本重复进样6针，连续3 d。计算3 d内1,5-AG峰面积的RSD，考察日间精密度。

1.4.8稳定性

按确定好的方法，平行处理6份低、中、高的标准品溶液和6份QC样本，分别将提取液放置4℃下保存。于0、12、24、48、72 h和1周不同时间点进行测试，每次重复进样6针。计算各时间点1,5-AG峰面积的RSD。

1.4.9准确度

取6份低、中、高的标准品溶液，采用确定好的提取溶剂，按相同的方法处理。用标准曲线法定量低、中、高标准品溶液的实际浓度与理论浓度的比值，考察准确度。

1.4.1 0加样回收率

平行取18份QC样本，每6份中加入低、中、高不同浓度的1,5-AG标准品溶液，采用所确定的提取溶剂，按相同的方法进行处理。用标准曲线法定量未加标准品溶液的QC样本以及加入不同浓度溶液后QC样本中的浓度，计算加样回收率。

1.4.1 1方法验证

采用所确定的测定方法，定量

10例健康对照、8例糖尿病前期和22例糖尿病血浆样本中1,5-AG的含量。

1.5统计学处理

采用SPSS 22.0统计学软件，相关性行Spearman相关分析，显著性用t-test双尾检验，以P<0.05为差异比较具有统计学意义。

2、结果

2.1最佳提取溶剂的确定

5种不同比例的提取溶剂对应1,5-AG的定量离子色谱图，如图1所示。结果显示随着甲醇比例的增加，色谱峰逐渐加宽，峰响应越来越低，而乙腈比例越高，色谱峰越窄、对称性好。虽然单纯的乙腈作为提取溶剂时，峰型最窄，但峰响应强度大约只有乙腈∶甲醇(8∶2,v∶v)的一半。综合考虑，乙腈∶甲醇(8∶2,v∶v)的提取效果最好，1,5-AG色谱峰半峰宽较窄，峰型对称，且响应强度最大，是较理想的提取溶剂。

图1不同比例的提取溶剂的1,5-AG定量离子色谱图

2.2 LOD值、LOQ值和线性关系

LOD值和LOQ值分别为0.002 5μg/m L,0.005μg/m L。在1～40μg/m L浓度范围内，线性回归方程为y=0.556 2x+0.067 8，相关系数r为0.998 8。表明1,5-AG在1～40μg/m L的浓度范围内具有良好的线性关系，满足定量的要求。

2.3重复性

1,5-AG低、中、高标准品和混合血QC样本的RSD为3.85%～6.08%，表明该方法具有良好的重复性。

2.4日内和日间精密度

日内精密度RSD为3.77%，日间精密度RSD为7.76%。表明该方法具有良好的精密度，满足定量的要求。

2.5稳定性

根据0、12、24、48、72 h和1周内1,5-AG低、中、高标准品溶液及QC样本1,5-AG的浓度所示，RSD为2.51～4.24%，表明1,5-AG在4℃环境下保存1周具有良好的稳定性。

2.6准确度

1,5-AG低、中、高标准品的准确度为97.28%～99.98%,RSD为2.72%～6.53%，表明该方法具有良好的准确度。

2.7加样回收率

平均加样回收率为96.92%～101.53%,RSD为6.52%～9.82%，表明该方法具有良好的回收率。

2.8方法验证结果

应用将血清样本采用所建立质量的方法进行1,5-AG浓度的测定。空腹时，糖尿病前期和糖尿病血中1,5-AG的浓度均分别低于健康对照(P<0.01和P<0.05)，但糖尿病前期与糖尿病之间差异比较无统计学意义(图2A)。同样，在OGTT 2 h时，糖尿病前期和糖尿病血中1,5-AG的浓度亦分别低于健康对照(均P<0.05)，并且糖尿病前期与糖尿病之间差异比较无统计学意义(图2B)。将本方法所测得的2 h血1,5-AG浓度与血糖值进行Spearman相关分析，结果显示血1,5-AG与餐后2 h血糖呈明显负相关(r=-0.51,P<0.01)，图3。

图2正常对照、糖尿病前期和糖尿病血浆1,5-AG浓度

图3餐后2 h血浆1,5-AG与餐后2 h血糖的相关性

3、讨论

糖尿病患者的血糖水平监控是诊断、治疗中的重要依据。近年来，血清1,5-AG作为血糖监控的短期标志物而倍受关注，并且越来越多的研究者不仅关注血中1,5-AG的含量，同时还关注唾液、玻璃体液、脑脊液等不同生物体液中1,5-AG的含量。Halama等[10]的研究表明唾液1,5-AG可用于糖尿病的无创筛查。早期Servo等[14]研究者发现糖尿病患者脑脊液中1,5-AG的水平降低。此外，Takata等[15]在47具尸体中研究发现玻璃体和脑脊液中1,5-AG的水平呈正相关，可为法医评估死者生前血糖水平提供重要的参考依据。由此可见1,5-AG在不同生物体液中具有重要的临床价值。目前GlycomarkTM试剂盒检测方法是通用的血中1,5-AG的定量方法，而1,5-AG在不同生物体液中的定量不仅受到样本中葡萄糖的干扰，还受到胆红素[16]、血红蛋白[16]、麦芽糖[17]、肌醇[18]、半乳糖[10]等类似物的影响，在准确定量前需要排除这些干扰因素。但去除干扰物的过程涉及到复杂的生化反应过程，需要严格控制温度、反应时间等条件，干扰物去除的与否完全会影响到测定1,5-AG的准确性。本研究建立了基于UPLC-TQMS的一种定量方法。样本前处理只需沉淀蛋白后即可上机检测，整个检测运行过程仅需6 min即能完成。该方法具有较高的灵敏度、重复性好、高精密度、准确度和稳定性，并且实际操作简单、快捷，适合于不同生物大样本的快速筛查需求，具有较强的推广应用价值。

本研究采用所开发的方法对健康对照、糖尿病前期和糖尿病患者中的血1,5-AG进行了定量，结果显示糖尿病前期和糖尿病患者的血1,5-AG的含量均显著低于健康对照，这与文献报道的用GlycomarkTM试剂盒测试糖尿病前期和糖尿病患者的结果相吻合[19]。但本次结果中提示糖尿病前期和糖尿病患者之间无显著性差异，这很可能与所用的样本数量较少、个体之间的差异较大有关。进一步分析可知，餐后2 h的血糖与1,5-AG之间存在显著的负相关关系，这与葡萄糖和1,5-AG在肾小管中共用相同的转运体有关。当尿中葡萄糖超过阈值后，转运体对二者的转运具有竞争性，对葡萄糖的转运增加，使血糖升高就会使得对1,5-AG的转运减少，血1,5-AG含量下降。该结果提示餐后的1,5-AG水平能较好反映餐后血糖的波动情况，与文献报道的结果相吻合[20]。

综上所述，UPLC-TQMS检测血清1,5-AG快速简单，实现对血清1,5-AG准确的定量，可为临床高通量样本的筛查提供切实可行的方法，同时也能为各种复杂生物样本中1,5-AG的定量方法提供参考。

参考文献：

[20]邓子玄,周健,贾伟平.1,5-脱水葡萄糖醇的临床应用及研究进展[J].中华老年多器官疾病杂志,2014,13(11):867-871.

瞿纯,葛坤,菅朝慧,马晓静,包玉倩,贾伟,赵爱华.血浆1,5-脱水葡萄糖醇的UPLC-TQMS定量方法研究[J].转化医学杂志,2020,9(04):238-242.

基金:国家自然基金项目(81772530,81974073);市医院新兴前沿技术联合攻关项目(SHDC12016108)