摘要:颗粒酶A(GzmA)是由自然杀伤细胞及细胞毒性T淋巴细胞分泌的丝氨酸蛋白酶,能够通过诱导细胞凋亡以及细胞焦亡来调节机体免疫防御,还能够杀灭侵入宿主细胞内的细菌及寄生虫来维持机体稳态。最近研究发现,GzmA通过调节IL-6、TNF-α等因子的释放,影响结核、脓毒症、类风湿性关节炎等疾病的发生及发展,还可激活pSTAT3促进肠道炎症及结直肠癌的发展。文章就GzmA的生理特征和功能,以及在炎症过程、自身免疫性疾病及肿瘤中的作用进行综述。
颗粒酶(granzymes,Gzms)是一类丝氨酸蛋白酶,主要由自然杀伤(naturekiller,NK)细胞及细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTLs)分泌,主要功能为诱导细胞凋亡[1]。迄今为止在人体中共发现了5种Gzms(A、B、H、K、M),而在小鼠中发现10种Gzms(A、B、C、D、E、F、G、K、M、N)。既往对于颗粒酶的研究主要集中于GzmB在细胞凋亡中的作用,发现其在Gzms诱导细胞凋亡过程中起主导作用。GzmA作为含量最丰富的颗粒酶,其诱导细胞凋亡能力仅次于GzmB,而某些鱼类的GzmA诱导细胞凋亡能力则强于GzmB[2]。近年来,越来越多的研究发现,GzmA除了诱导程序性细胞死亡外,还在炎症过程、自身免疫性疾病及肿瘤的发生发展中发挥重要作用。
1、GzmA的一般特性
1.1GzmA的合成与调控
GzmA的结构类似于胰蛋白酶,切割位点位于精氨酸或赖氨酸之后,GzmA基因在人类及小鼠中分别位于5号及13号染色体,相对分子质量为52000[3]。Gzms在体内的合成与释放都需要经过一系列相同的步骤。Gzms首先被合成为无活性的前体分子,前体分子中包含分选信号及N-末端二肽,在分选信号的引导下前体分子被引导入内质网中加工。前体分子的N-末端二肽只能被细胞毒性颗粒中组织蛋白酶C(cathepsinC)分解,才能激发颗粒酶活性[4]。研究报道,组织蛋白酶C缺陷导致颗粒酶不能激活,与Papillon-Lefèvre综合征(亦称为掌跖角化-牙周破坏综合征)发病相关[5]。当杀伤细胞识别特定的靶细胞时,杀伤细胞释放细胞毒性颗粒进入与靶细胞之间形成的免疫突触中,Gzms通过细胞毒性颗粒中的穿孔素(peforin,PFN)进入靶细胞,激活胞内特定的信号转导通路从而发挥作用[6]。Gzms在体内发挥作用受丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin家族的调控,Serpinb6b和Serpinb12能够抑制外周循环中的GzmA[7,8]。
1.2GzmA与细胞凋亡
细胞凋亡(apoptosis)是程序性细胞死亡的一种。既往研究发现,Gzms的主要功能为诱导细胞凋亡,不同Gzms诱导细胞凋亡所涉及的信号通路不完全一样。GzmB作用于线粒体产生细胞色素c,激活caspase依赖途径导致细胞凋亡[1]。而GzmA主要通过非caspase途径诱导细胞凋亡,通过PFN进入靶细胞内的GzmA在热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)70和HSP90帮助下穿过线粒体膜,进入线粒体基质GzmA蛋白水解电子传递链(electrontransportcomplex,ETC)中的NADH脱氢酶(泛醌)铁硫蛋白3(NADHdehydrogenase[ubiquinone]ferrithionein3,NDUFS3),干扰线粒体的正常代谢功能,从而导致活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)产生,通过ROS诱导内质网相关SET复合物易位到细胞核,SET复合物释放的NM23-H1和TREX-1两种核酸酶能引起单链DNA损伤,从而导致细胞凋亡[3]。ETC结构和功能的完整性在GzmA诱导ROS的产生中起重要作用,当用鱼藤酮抑制ETC时,GzmA诱导ROS产生以及细胞凋亡将会被抑制,另外当NDUFS3的水解位点突变时,ROS的产生以及细胞凋亡也会被抑制[3]。GzmA还可作用于DNA双链修复蛋白Ku70,影响受损DNA的修复[9]。
1.3GzmA与细胞焦亡
细胞焦亡是近年来才发现的由Gasdermin所介导的程序性细胞死亡方式[10]。与细胞凋亡不同的是,细胞焦亡过程伴随着炎症发生,是一种促炎形式的细胞死亡[11]。既往认为,细胞焦亡的完成依赖于caspase活化[12]。但最近研究发现,NK细胞分泌的GzmA通过穿孔素进入靶细胞内,蛋白水解GasderminB从而诱导细胞焦亡过程的发生,而且该过程不涉及caspase的活化[13]。进一步研究证实,该过程还能够增强机体抗肿瘤能力[13]。
1.4GzmA的灭菌能力
人类生活在充满病原体的环境中,机体的免疫系统可以抵御病原体入侵。人类NK细胞以及CTLs分泌的细胞毒性颗粒中还包含一种叫颗粒溶素(granulysin,GNLY)的蛋白[14],其能帮助Gzms杀灭宿主细胞内的细菌及寄生虫。Gzms和GNLY可以通过PFN形成的孔道进入被细菌感染的细胞内,Gzms借助GNLY进入胞内的细菌体内后作用于ETC产生ROS,通过ROS诱导细菌快速死亡[15]。该过程可以通过杀死宿主细胞内的细菌来增强机体的抗菌能力,而不是直接诱导宿主细胞死亡来减少细菌的复制。Gzms杀灭宿主细胞的寄生虫过程与细菌相似,Gzms在PFN及GNLY的帮助下分别穿过细胞膜及寄生虫膜,诱导寄生虫产生ROS,摧毁其氧化防御系统,从而导致寄生虫死亡[16]。在此过程中,胞内寄生虫会先于宿主细胞死亡,这能限制寄生虫的进一步传播。
2、GzmA与感染性疾病
2.1GzmA诱导巨噬细胞分泌TNF-α抑制结核杆菌生长
研究发现,结核病患者血清中的Gzms和PFN水平低于健康人[17]。结核活动期与潜伏期血清中的GzmA水平较正常人显著下降,而且活动期下降的更加明显[18]。检测血清中GzmA浓度可能为结核的诊断及鉴别带来帮助。γ9δ2T细胞对包括结核分枝杆菌在内的病原微生物有很强的抑制作用,而人们既往对于具体机制尚不清楚。最近研究发现,其抑制作用与γ9δ2T细胞产生的GzmA有关。GzmA诱导巨噬细胞产生TNF-α,通过TNF-α抑制结核杆菌生长,并且GzmA水平与细胞内分枝杆菌生长抑制之间存在高度显著的相关性,敲除GzmA将会损害γ9δ2T细胞对结核杆菌的生长抑制作用[19]。
2.2GzmA诱导巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α等细胞因子影响脓毒症的发生发展
细菌性脓毒症的发生与细菌侵入机体导致大量炎症因子释放有关。GzmA能刺激成纤维细胞和上皮细胞释放促炎细胞因子IL-6和IL-8[20],还能促进巨噬细胞产生IL-6[21],提示GzmA在脓毒症的发生中起一定的促进作用。小鼠实验发现,敲除GzmA的小鼠感染布鲁菌发生脓毒症时,小鼠的存活率会明显上升,进一步研究证实这主要与NK细胞产生的GzmA刺激IL-1a、IL-1b、TNF-a、IL-6等炎症因子的生成减少有关[22]。腹膜炎是诱发脓毒症的重要原因之一。研究发现,继发于腹膜炎的脓毒症患者血清中GzmA明显升高[23],提示GzmA在这一病理中起重要作用。进一步研究发现,血中升高的GzmA将会诱导巨噬细胞产生IL-6和TNF-α等促炎因子,加重脓毒症的发展。当在小鼠实验中使用Serpinb6b抑制GzmA的功能时,脓毒症小鼠的生存率明显升高[23]。是否可以通过使用GzmA的拮抗剂减少某些细胞因子的产生,达到预防脓毒症的发生以及减缓败血症的发展有待进一步研究。
2.3GzmA影响病毒复制
CD4+T细胞是人体感染艾滋病病毒后被攻击的主要免疫细胞,其数目及功能对评估治疗效果及患者免疫功能具有重要意义。研究发现,艾滋病早期血中HIV特异性CD4+T细胞所表达的GzmA越高,CD4+T细胞数目维持在正常范围的时间越长,且血中HIV滴度越低[24]。说明GzmA对控制病毒复制具有重要作用,这或许能为评估艾滋病的治疗效果提供重要工具。另一项研究发现,当感染奇昆古尼亚病毒(chikungunyavirus)后,患者血中GzmA浓度会明显升高,并且血中的病毒滴度和疾病评分与GzmA升高的水平相关[25]。以上研究说明GzmA能够抑制某些病毒的复制,但其具体的机制需要进一步研究。
3、GzmA与非感染性疾病
3.1GzmA通过诱导破骨细胞分化影响类风湿性关节炎的发生发展
类风湿性关节炎(rheumaticarthritis,RA)是一种自身免疫性疾病,与破骨细胞被促炎细胞因子过度活化有关[26]。破骨细胞由骨髓内未成熟的前体细胞转化而来,前体细胞可以分泌TNF-α,促进自身成熟转化为破骨细胞[27]。研究发现,GzmA可促进前体细胞TNF-αmRNA的表达,进而促进破骨细胞分化,在一定程度上可加重RA的病情[28]。IFN-γ、IL-6、IL-17、TNF等促炎因子在RA患者的血清中明显升高,而在敲除GzmA的RA小鼠中发现,这些促炎因子在血清中的浓度明显下降,证明这些促炎因子是GzmA刺激细胞释放的来源之一[28]。敲除或阻断GzmA的作用,或许能够缓解RA的发生及发展,这为RA的治疗带来新的靶点。
3.2GzmA通过调节IFN-I的表达影响1型糖尿病的发生
研究发现,GzmA缺陷可能也是1型糖尿病(type1diabetes,T1D)的易感因素之一,因为在T1D患者血清中发现,其T细胞表达的GzmA明显下降,并且在动物实验中证实,缺乏GzmA时,T1D的发生率会明显上升[29]。在另一项研究中,实验人员敲除非肥胖糖尿病小鼠的GzmA基因发现,小鼠胰岛中IFN-I调节基因的表达与对照组相比明显上升,IFN-I能够激活小鼠体内的T细胞,打破免疫耐受,导致胰岛β细胞被破坏[30]。同时,GzmA缺乏导致胰岛及脾脏中的树突状细胞和NK细胞单链DNA异常积累。单链DNA作为一种内源性信号,也能够刺激局部IFN-I的产生,进一步加重胰岛的破坏[30],但具体的信号通路有待进一步研究证实。
3.3GzmA激活肠癌细胞pSTAT3,促进肠道炎症及结直肠癌的发展
溃疡结肠炎(ulcerativecolitis,UC)是一种慢性非特异性炎症性疾病,病变主要累及结肠以及直肠,临床表现为持续或反复发作的腹痛、腹泻、黏液血便、里急后重和不同程度的全身症状。研究发现,结肠组织中GzmA的表达受CD4+T细胞调控,UC患者结肠细胞中GzmA水平较正常人升高[31]。临床研究发现,在etrolizumab单抗治疗的UC患者中,高水平的GzmA与UC的临床缓解及黏膜愈合呈正相关[32]。一项关于UC患者罹患结肠癌的队列研究发现,与正常人相比,UC患者罹患结肠癌的风险明显增加[33]。动物实验发现,细胞外GzmA能够诱导巨噬细胞产生IL-6,激活结肠癌细胞中的pSTAT3信号,间接促进肠道炎症以及结直肠癌的发展[21]。当使用Serpin6b拮抗GzmA的作用或敲除GzmA后,肠炎小鼠结肠中的IL-6、TNF-α等炎症因子水平明显下降,小鼠的肠道炎症明显减轻并且大大减缓结肠癌的发展[21]。拮抗GzmA的作用可能成为UC以及结肠癌的新治疗靶点。
综上,目前研究表明GzmA介导细胞凋亡和细胞焦亡,诱导炎症因子释放,参与机体抵御致病菌感染,并与某些自身免疫性疾病及结肠肿瘤的发生有关,病理生理学机制尚未完全了解。GzmA在不同疾病中的作用机制不同,其血清或组织中的表达水平不同,GzmA表达水平对疾病的诊断和疗效评估作用有待进一步研究。激活或抑制GzmA与疾病发生进展相关,使用GzmA激动剂或抑制剂可能为疾病防治带来新的靶点。
文章来源:牛荣威,杨敏.颗粒酶A及其相关疾病的研究进展[J].临床儿科杂志,2021,39(09):711-714.
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