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姜黄素对前列腺癌细胞增殖、侵袭及细胞周期的影响

2024-10-14 172 上传者：管理员

摘要：目的探讨姜黄素对人雄激素非依赖性前列腺癌C4-2细胞和典型人雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞增殖、侵袭及细胞周期的影响。方法取对数生长期C4-2细胞和LNCaP细胞，分为正常对照组，20、40、60、80μmol/L姜黄素组。姜黄素处理24 h后，采用MTT法检测各组细胞增殖活性；选取20、40μmol/L姜黄素组作为试验组，未处理组作为对照组，各组细胞处理24 h后，采用流式细胞术检测经姜黄素处理的C4-2细胞和LNCaP细胞的细胞周期；采用Transwell小室试验检测对照组C4-2、LNCaP细胞及20、40μmol/L姜黄素组细胞体外侵袭数量。结果 MTT结果显示，与正常对照组比较，不同浓度姜黄素组C4-2细胞和LNCaP细胞增殖活性明显降低（P<0.05或P<0.01）;流式细胞术检测结果显示，应用20、40μmol/L姜黄素处理后，G2/M期阻滞且G2/M期细胞比例均高于正常对照组（P<0.05或P<0.01）;Transwell小室试验结果显示，与正常对照组比较，姜黄素处理组C4-2细胞和LNCaP细胞体外侵袭数量明显降低（P<0.01）。结论姜黄素对人前列腺癌C4-2细胞、LNCaP细胞的增殖、侵袭具有抑制作用，且使细胞周期阻滞在G2/M期。

关键词：
PCa
前列腺癌
增殖
姜黄素
细胞周期
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前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)已成为影响男性健康的重大问题，也是癌症相关死亡的常见原因，每年约有160万新增病例和36.6万死亡病例[1]。前列腺癌在临床上是一种异质性很强的疾病，多数患者表现为侵袭性，伴有进展和转移[2]。由于前列腺癌在疾病早期无症状，因此对前列腺癌的预防、诊断和针对性治疗尤为重要。癌症是一种以细胞增殖速率显著提高和细胞死亡逃避为特征的疾病。基因突变破坏了控制和促进体内平衡的关键信号通路，导致癌基因异常激活，下游通路异常活化，进而诱发细胞癌变、细胞功能发生失调[3-4]。姜黄素(Curcumin)是一种姜黄衍生的多酚，具有抗炎、抗氧化和抗菌特性，用于癌症治疗。据报道[5-6],姜黄素具有抗增殖和促凋亡特性，能够逆转、抑制、防止癌变和癌症进展。多项动物试验研究[7-8]表明：姜黄素对不同类型癌症(包括PCa)具有剂量依赖性化学预防作用。因此，本研究主要观察姜黄素对人PCa细胞增殖、侵袭的影响，并探讨细胞周期在其中的变化，阐明可能的作用机制，为PCa早期预防、诊断和针对性治疗提供参考。

1、材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

人PCa LNCaP细胞和C4-2细胞，吉林医药学院生物化学与分子生物学实验室；姜黄素，美国Sigma Aldrich公司；溴化四氮唑蓝(MTT),中国Biosharp公司；RPMI Medium 1640培养基，美国Gibco公司；基质胶Matrigel, 美国CORNING公司；细胞周期检测试剂盒，北京索莱宝公司；结晶紫染色液，碧云天生物有限公司；倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；伯乐-550型全自动酶标仪，上海领成生物科技有限公司；C6流式细胞仪，美国BD公司。

1.2 细胞培养

细胞在37 ℃、5% CO2条件下培养，培养基为RPMI-1640,含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和链霉素100 mg/L。将培养的C4-2细胞和LNCap细胞分为阴性对照组、姜黄素20 μmol/L和40 μmol/L组。

1.3 MTT法检测各组细胞增殖活性

将培养的C4-2细胞、LNCaP细胞用胰蛋白酶消化，在显微镜下观察到70%～80%细胞形态收缩时，加入一定量含有血清的培养液终止消化；转移至离心管，3 000 r/min离心4 min; 离心后用细胞计数板计算细胞数量，在培养皿中加入细胞悬液和一定量培养液，以每孔104个细胞接种于96孔细胞培养板，放入细胞培养箱中培养24 h; 将配制好的姜黄素以 20、40、60、80 μmol/L的浓度干预24 h, 0 μmol/L姜黄素组作为对照组，每孔5 g/L MTT,20 μL孵育4 h, DMSO溶解蓝紫色结晶，在波长490 nm处测定各组吸光度(OD值)。

1.4 流式细胞术检测各组细胞周期

取对数生长期细胞，弃旧培养液；将细胞用2 mL PBS缓冲液洗2次，加入1 mL胰酶消化，用1 mL培养液重悬离心管内细胞沉淀，制成细胞悬液；显微镜下计数细胞，并配置浓度为5×105个/mL的细胞悬液；将细胞悬液接种于6孔细胞培养板，置于细胞培养箱培养24 h; 将6孔细胞培养板中各组细胞分别加入姜黄素至终浓度为0、20、40 μmol/L,放入培养箱培养24 h; 将细胞悬液转移至离心管内，1 500 r/min离心5 min, 离心管内各加入1 mL预冷PBS缓冲液，离心，第2次洗细胞；样本测定前，4 ℃、1 500 r/min离心10 min, 收集已固定的细胞样本；离心后弃去上清液，加入1 mL预冷的PBS缓冲液清洗2次，重复离心，弃去上清液；每个EP管内加入PI染液(PI/RNase Staining Buffer)500 μL,并将细胞重悬；室温避光孵育15 min, 应用流式细胞仪检测细胞周期。

1.5 Transwell小室试验检测各组侵袭细胞数量

取对数生长期细胞，弃旧培养液，用PBS缓冲液洗细胞2次，弃去PBS缓冲液；加入6 mL无血清培养基，将细胞饥饿培养6 h, 然后制成细胞悬液；显微镜下计数细胞，并配置浓度为5×104个/mL的细胞悬液；将隔夜缓化的Matrigel基质胶与预冷的无血清基础培养基按照18进行配置；取稀释后的Matrigel基质胶，垂直加到Transwell小室的上室，均匀铺底，培养箱内孵育2 h, 使基质胶成膜弃掉；弃掉上室中的多余液体，每孔加入100 μL无血清培养基，培养30 min, 进行基底膜水化；在24孔细胞培养板内的下室中各加入500 μL含有姜黄素浓度为0、20、40 μmol/L的20%血清培养液，将制好的细胞悬液加到Transwell小室的上室中，每孔200 μL,置于培养箱培养24 h; 培养结束后，使用4%多聚甲醛对Transwell小室进行固定，然后用PBS缓冲液清洗Transwell小室3次，用结晶紫染液进行10 min, PBS缓冲液清洗3次，光学显微镜下对Transwell小室下的细胞进行拍照；细胞侵袭数=(试验组细胞数/空白对照组细胞数)×100%。此试验重复3次。

1.6 统计学分析

应用GraphPad Prism 9.0.2对数据进行处理与统计学分析。计量数据以均数±标准差

表示，细胞增殖活性、细胞侵袭数量和细胞周期水平等多组间样本均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 姜黄素对C4-2细胞和LNCaP细胞增殖能力的影响

姜黄素处理24 h后，与对照组比较，不同浓度姜黄素作用下的C4-2细胞和LNCaP细胞增殖活性明显降低，其中80 μmol/L姜黄素组增殖抑制作用最为明显(P<0.01或P<0.001);组间比较结果显示，与20 μmol/L姜黄素组比较，随着姜黄素浓度的提高，组间差异愈加明显，抑制作用明显增强(P<0.01),见图1。

图1 C4-2细胞和LNCaP细胞增殖活性

与对照组比较，*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;与20 μmol/L姜黄素组比较，#.P<0.05,##.P<0.01,###.P<0.001。

2.2 姜黄素对C4-2细胞和LNCaP细胞周期的影响

通过PI单通道染色、流式细胞术检测人PCa C4-2细胞和LNCaP细胞的细胞周期变化。图2～3显示，与正常对照组比较，不同浓度姜黄素处理C4-2细胞和LNCaP细胞后，G0/G1期细胞比例降低，而G2/M期被明显阻滞(P<0.05或P<0.01);与对照组比较，40 μmol/L姜黄素组细胞G2/M期阻滞更加明显(P<0.05或P<0.01)。结果表明，姜黄素可降低人PCa C4-2细胞和LNCaP细胞G0/G1期细胞的比例，显著增加G2/M期细胞比例。

2.3 姜黄素对C4-2细胞和LNCaP细胞侵袭能力的影响

通过Transwell小室试验检测姜黄素对人PCa C4-2细胞和LNCaP细胞侵袭的影响，结果表明，与对照组比较，不同浓度(20、40 μmol/L)的姜黄素处理24 h后，C4-2细胞和LNCaP细胞的侵袭能力显著降低(P<0.01),且随着姜黄素药物浓度的升高，细胞侵袭能力逐渐下降，见图4～5。

图2 C4-2细胞周期变化

与对照组比较，*.P<0.05,**.P<0.01。

图3 LNCaP细胞周期变化

与对照组比较，*.P<0.05,**.P<0.01。

图4 各组C4-2细胞侵袭情况

与对照组比较，**.P<0.01。

图5 各组LNCaP细胞侵袭情况

与对照组比较，**.P<0.01。

3、讨论

目前，前列腺癌患者的治疗选择主要取决于肿瘤性质、特异性标志物等，而前列腺癌分为雄激素敏感型或不敏感型[9-11],因此，本研究选取典型的雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞及与成骨纤维细胞系MS相互作用得到的恶性程度较高的人雄激素非依赖性前列腺癌C4-2细胞进行研究。因前列腺癌早期无症状，但在癌症后期可能会产生尿频、夜尿、血尿、尿潴留和排尿伴盆腔疼痛等症状[12]。而手术和放疗对转移性肿瘤无效，激素剥夺治疗对雄激素不敏感和去势抵抗性癌症无效，化疗的不良反应严重损害患者生活质量。因此，在前列腺癌治疗中，迫切需要新的治疗方式。

近年来，随着医学与分子生物学发展，人们对姜黄素抗诱变及抗癌作用有了进一步认识。姜黄素是一种高度多效性化合物，通过改变细胞基因表达和信号通路影响、调节多种分子靶标。由于多靶向特性，姜黄素能够调节多种转录因子、炎性细胞因子和细胞凋亡蛋白，而这些因子在癌症中经常失调[13]。除了抗癌特性外，姜黄素还是一种有效的化学和放射增敏剂[14-16]。此外，姜黄素具有毒性低、副作用少的特点[17]。

前列腺癌的起始和进展与细胞增殖和细胞周期失调增强有关。在前列腺癌进展过程中，只有更好地了解控制细胞分裂、增殖及促增殖的分子机制，才有可能最终克服治疗的耐药性。细胞增殖异常和细胞周期异常是所有人类癌症的标志，包括前列腺癌[18]。真核生物的典型细胞周期由 G0、G1、S、G2和M期组成，要保证子代细胞遗传的一致性，关键是要确保细胞周期的正常推动。细胞各周期检查点有各自的生理作用，G1期检查点监测细胞是否可以进入S期，S期检查点主要观测DNA是否发生损伤，G2期检查点主要观测有丝分裂开始前其准备工作是否完善，M期检查点观测染色体能否精准分配到纺锤体两极[19],而这些检查点中最重要的是G2/M期。当DNA受损时，G2期可防止细胞进入有丝分裂，从而为修复和阻止受损细胞增殖提供机会。由于G2期有助于维持基因组稳定性，因此，它是了解癌症分子原因的重要焦点[20]。细胞G2/M期阻滞介导的主要是P53基因，P53通过转录产物抑制Cyclin B1相关基因表达，调控下游基因p21等，将细胞阻滞于G2/M期。大多数细胞事件，包括 DNA 复制、基因转录、蛋白质翻译和蛋白质的翻译后修饰，都以细胞周期依赖性方式发生[21]。本研究中，我们将姜黄素作用于人前列腺癌C4-2细胞、LNCaP细胞24 h后，应用流式细胞术测定细胞周期，结果显示，G0/G1期比例降低，G2/M期比例提高，细胞G2/M期阻滞，表明姜黄素能够抑制前列腺癌C4-2细胞、LNCaP细胞分裂、增殖。结合MTT试验可知，姜黄素对C4-2细胞和LNCaP细胞具有明显的增殖抑制作用，且两种细胞对姜黄素的敏感性不同。不同浓度组间比较显示，随着姜黄素浓度升高，其抑制作用不断增强，组间差异愈加明显。

Transwell小室试验Matrigel基质胶内含有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、纤连蛋白及触角蛋白等，这些均为人体ECM的大多数成分。为探讨姜黄素抑制癌细胞侵袭、迁移能力，通过 Transwell小室试验模拟较为真实的体内环境，检测肿瘤细胞的侵袭性，结果发现，与正常前列腺癌细胞比较，给予姜黄素后前列腺癌C4-2细胞、LNCaP细胞侵袭能力降低，表明前列腺癌细胞侵袭行为受到姜黄素药物抑制。本研究结果表明，姜黄素可抑制体外前列腺癌细胞的增殖、侵袭，并将细胞周期阻滞在G2/M期，而其机制还需进一步探讨。

参考文献:

[13]谭兆峰.基于NF-κB相关炎性信号通路探讨芪连扶正胶囊抑制肺癌增殖与转移的机制研究[D].济南:山东中医药大学,2021.

[19]吴巨钢,姜波健.细胞周期中胃癌相关基因的研究进展[J].实用医学杂志,2007,23(22):3487-3489.

[20]张瑞涛,史惠蓉,任芳,等.二烯丙基二硫化物诱导 G2/M 期阻滞对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响[J].中国医学科学院学报,2019,41(1):43-52.

基金资助:吉林省科技发展计划项目(YDZJ202101ZYTS123); 吉林省卫生健康委员会项目(2022JC025); 北华大学研究生创新项目(2022012);

文章来源:王馨,陈姝彤,侯宗昊,等.姜黄素对前列腺癌细胞增殖､侵袭及细胞周期的影响[J].北华大学学报(自然科学版),2024,25(06):770-775.