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灵芝多糖对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响及作用机制

2024-06-26 44 上传者：管理员

摘要：目的探讨灵芝多糖对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。方法人前列腺癌细胞(DU145)分别给予灵芝多糖低、中、高剂量(20、40、80 mg/ml)干预后，噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡；采用流式细胞术检测细胞中活性氧水平，酶联免疫吸附试验检测细胞中谷胱甘肽水平；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹分别检测谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、谷氨酸半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)、硫氧还蛋白还原酶(TXNRD)1 mRNA和蛋白表达。结果 DU 145半数抑制浓度(IC50)为40.35 mg/ml,接近40 mg/ml,因此将40 mg/ml作为(中等剂量)用于实验，即将IC50的50%、100%、200%作为灵芝多糖低、中、高剂量，分别为20、40、80 mg/ml用于后续实验。灵芝多糖不同剂量组DU145细胞凋亡率明显高于对照组，其中灵芝多糖高剂量组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率明显高于灵芝多糖中、低剂量组，灵芝多糖中剂量组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率明显高于灵芝多糖低剂量组(P<0.01)。灵芝多糖不同剂量组细胞活性氧水平明显高于对照组，谷胱甘肽水平明显低于对照组；其中灵芝多糖高剂量组细胞活性氧水平明显高于灵芝多糖中、低剂量组，谷胱甘肽水平明显低于灵芝多糖中、低剂量组(P<0.05);灵芝多糖中剂量组细胞活性氧水平明显高于灵芝多糖低剂量组，谷胱甘肽水平明显低于灵芝多糖低剂量组(P<0.05)。灵芝多糖不同剂量组DU145中GCLC、GCLM、TXNRD1 mRNA和蛋白表达明显低于对照组(P<0.05),其中灵芝多糖高剂量组DU145中GCLC、GCLM、TXNRD1 mRNA和蛋白表达明显低于灵芝多糖中、低剂量组，灵芝多糖中剂量组DU145中GCLC、GCLM、TXNRD1 mRNA和蛋白表达水平明显低于灵芝多糖低剂量组(P<0.05)。结论灵芝多糖可通过抑制抗氧化因子GCLC、GCLM、TXNRD1表达，减少谷胱甘肽生成，进而促进前列腺癌细胞中活性氧产生，诱导细胞凋亡。

关键词：
前列腺癌细胞
恶性肿瘤
灵芝多糖
细胞凋亡
细胞增殖
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前列腺癌约占男性恶性肿瘤的7.1%,高峰发病年龄在60岁以上，随着我国人口老龄化的加剧，其发病率可能还会进一步上升[1]。研究报道显示，老年人易患前列腺癌可能与前列腺组织发生退行性改变、易形成恶性肿瘤及遗传因素、饮食和生活方式等多种因素有关[2]。手术治疗在前列腺癌的治疗中占有重要地位，可通过去除大部分的癌细胞从而达到治疗的目的，但手术治疗也存在手术并发症、尿失禁、性功能障碍、术后复发等风险，其中术后肿瘤复发、转移是患者不良预后的主要原因[3]。近年来，我国传统中医药在肿瘤治疗中的作用受到了临床广泛关注，可通过调理患者体质、提高免疫力、加速毒素代谢等方式减轻化疗和放疗带来的副作用，部分中药具有抗肿瘤作用，能够抑制肿瘤细胞的生长和扩散、促使肿瘤细胞凋亡[4]。灵芝是我国传统中药材，具有增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化等多种生物学功能，多糖、三萜是其主要活性成分[5]。本研究探讨灵芝多糖对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。

1、材料与方法

1.1主要材料与试剂

人前列腺癌细胞(DU145)购于上海通派生物科技有限公司；灵芝多糖(批号：0287181)购于四川省维克奇生物有限公司。胎牛血清、青霉素/链霉素、DMEM培养基购于美国Zeta Life公司；噻唑蓝(MTT)检测试剂盒、双染细胞凋亡检测试剂盒、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒购于上海爱必信生物有限公司；活性氧检测试剂盒(绿色荧光)、谷胱甘肽酶联免疫吸附试验定量分析试剂盒购于上海佰利莱生物有限公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒、逆转录试剂盒购于杭州纽罗西敏生物有限公司；兔抗人谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)单克隆抗体、兔抗人谷氨酸半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)单克隆抗体、鼠抗人硫氧还蛋白还原酶(TXNRD)1单克隆抗体、兔抗人β-actin单克隆抗体及相对应的二抗购于上海优宁维生物科技股份有限公司。

1.2细胞培养与细胞增殖实验

DU145细胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，放于培养瓶中在CO2培养箱中孵育，定期观察细胞生长情况并进行传代培养。使用MTT法进行细胞增殖实验来筛选灵芝多糖使用剂量，首先将对数生长期的人DU145接种在96孔板中，放入CO2培养箱中孵育至细胞贴壁生长，使用DMEM培养基将灵芝多糖配制成浓度为10、20、40、80 mg/ml的溶液，对照组仅加入DMEM培养基，培养24 h,每孔中加入5 mg/ml的MTT溶液20μl,培养4 h,小心吸弃孔内培养上清液，每孔中加入150μl的二甲亚砜，振荡10 min后使用酶标仪在490 nm波长下测定各孔的光密度值，计算半数抑制浓度(IC50),筛选后续实验灵芝多糖的使用剂量，分为灵芝多糖低、中、高3个剂量组。之后按照上述操作过程检测灵芝多糖不同剂量组和对照组前列腺癌细胞的吸光度值，计算细胞增殖抑制率=(实验组吸光度值-对照组吸光度值)/对照组吸光度值×100%。

1.3细胞凋亡检测

取对数生长期的DU145,根据实验分组加入相应浓度的灵芝多糖，同时留出对照组用于比较；使用固定液对细胞进行固定处理以保持其结构和功能不变，同时通过固定染色方法标记细胞核，使用凋亡标记试剂对细胞进行染色，膜联蛋白酶(Annexin)Ⅴ可用于标记在细胞膜翻转的磷脂头部，碘化丙啶(PI)可用于标记细胞核。将染色后的细胞悬液通过流式细胞仪逐个检测每个细胞的荧光信号和散射信号，并生成相关的数据，通过不同通道检测标记染色的信号可以区分凋亡细胞和非凋亡细胞，记录凋亡细胞的百分比。

1.4细胞中活性氧和谷胱甘肽水平检测

取各组对数期DU145,流式细胞术检测细胞中活性氧水平，使用活性氧检测试剂盒中的荧光探针对细胞进行染色，将染色后的细胞悬液通过流式细胞仪进行分析，记录活性氧阳性细胞比例。酶联免疫吸附试验检测细胞中谷胱甘肽水平，按照标准品提供的浓度配制不同浓度的标准品溶液，包括零浓度、低浓度、中等浓度和高浓度，逐一加入酶标板相应的孔中；将待测样本及质控品加入酶标板相应的孔中，留出适当的空白孔作为对照；将含有特异性抗体的工作液加入每个孔中使抗体能够与谷胱甘肽结合，洗涤后加入底物液，使其与酶标记的抗体结合产生显色反应，加入停止液中止底物液的反应，使用酶标仪测定各孔的吸光度值，根据标准曲线计算出谷胱甘肽的浓度。

1.5逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测GCLC、GCLM、TXNRD1mRNA表达

使用Trizol试剂提取各组DU145总RNA,逆转录合成cDNA,建立PCR体系，包括模板cDNA、上下游特异性引物、耐热DNA聚合酶及双蒸水，引物设计与合成由杭州纽罗西敏生物有限公司完成，GCLC上游引物：5′-GTCGGTGTCAAAATACGGAGTTCCA-3′,下游：5′-CGTGA-CGAGGACTGCGTGCAT GGAT-3′。GCLM上游引物：5′-CCGATGACGCCATAAACGTCCGTAGC-3′,下游：5′-GGCTAAGCGTACGTAGTACGCAACGTA-3′。TX-NRD1上游引物：5′-TGACAGTCCTACCGTACGTA-GAATGCC-3′,下游：5′-ATAATGCGTAGGGATGCGC-TAGCAATGG-3′。β-actin上游引物：5′-TTAGGCG-CGATGCAGTCAGATAAGC-3′,下游：5′-ATCGACGTACGTACGGACGCGATAG-3′。扩增条件：95℃预变性60 s、95℃变性30 s、60℃复性30 s、72℃延伸60 s。产物可通过凝胶电泳进行检测观察是否出现预期大小的条带，以参照基因β-actin为标准对GCLC、GCLM、TXNRD1 mRNA表达水平进行相对定量分析。

1.6 Western印迹检测GCLC、GCLM、TXNRD1蛋白表达

使用RIPA裂解液提取各组DU145的总蛋白，并进行BCA蛋白定量检测；取适量蛋白样品溶解在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白负载缓冲液中，并测定蛋白质的浓度，根据蛋白质大小将样品进行SDS-PAGE分离，然后将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜；将膜进行蛋白固定、阻断和抗体标记，加入兔抗人GCLC单克隆抗体、兔抗人GCLM单克隆抗体、鼠抗人TXNRD1单克隆抗体、兔抗人β-actin单克隆抗体，4℃过夜，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温摇床孵育2 h,化学放光法成像，使用ImageJ软件进行灰度分析。

1.7统计学分析

采用SPSS25.0软件进行方差分析、LSD-t检验。

2、结果

2.1灵芝多糖剂量筛选

DU145 IC50为40.35 mg/ml,接近40 mg/ml,因此将40 mg/ml作为中等剂量用于实验，即将IC50的50%、100%、200%作为灵芝多糖低、中、高剂量，分别为20、40、80 mg/ml用于后续实验。

2.2各组DU145增殖和凋亡比较

灵芝多糖不同剂量组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.01),其中灵芝多糖高剂量组以上指标明显高于灵芝多糖中、低剂量组，灵芝多糖中剂量组以上指标明显高于灵芝多糖低剂量组(P<0.01)。见表1。

2.3各组列腺癌细胞活性氧、谷胱甘肽水平比较

灵芝多糖不同剂量组细胞活性氧水平明显高于对照组，谷胱甘肽水平明显低于对照组(P<0.05);其中灵芝多糖高剂量组细胞活性氧水平明显高于灵芝多糖中、低剂量组，谷胱甘肽水平明显低于灵芝多糖中、低剂量组(P<0.05);灵芝多糖中剂量组细胞活性氧水平明显高于灵芝多糖低剂量组，谷胱甘肽水平明显低于灵芝多糖低剂量组(P<0.05)。见表2。

2.4各组DU145中抗氧化因子表达水平比较

灵芝多糖不同剂量组DU145中GCLC、GCLM、TXNRD1 mRNA和蛋白表达明显低于对照组(P<0.05),其中灵芝多糖高剂量组DU145中GCLC、GCLM、TXNRD1 mRNA和蛋白表达明显低于灵芝多糖中、低剂量组，灵芝多糖中剂量组DU145中GCLC、GCLM、TXNRD1 mRNA和蛋白表达明显低于灵芝多糖低剂量组(P<0.05)。见表2、图1。

表1各组DU145增殖和凋亡比较

表2各组DU145活性氧、谷胱甘肽及细胞中抗氧化因子表达水平比较

图1各组DU145中抗氧化因子蛋白表达

3、讨论

前列腺癌是发生于男性前列腺的上皮性恶性肿瘤，相对于发达国家，我国的前列腺癌发病率和死亡率相对较低，可能与我国男性生活方式、遗传因素、饮食结构等因素有关[6]。但随着我国居人口老龄化的增加，其发病率呈逐年上升趋势[7]。遗传因素、高脂肪、高蛋白的饮食习惯可能增加前列腺癌的发生风险，应保持适量运动、均衡饮食、戒烟限酒等健康的生活方式，降低前列腺癌的发病风险[8]。目前前列腺癌的临床治疗方法包括内分泌治疗、放疗、手术、靶向药物、免疫疗法等，为进一步提升疗效，我国传统中医药的应用受到了广泛关注。中医治疗不仅仅是针对前列腺癌这一局部病灶，而是从患者的全身状况出发，调整阴阳平衡，进而增强机体免疫力，有助于控制病情发展；对于接受手术、放疗、化疗等治疗的前列腺癌患者，中药能够减轻副作用，改善患者恶心、呕吐、疲劳等症状，提高生存质量；此外，部分中药还能够增强化疗药物的疗效，减轻放疗的毒性反应，帮助患者更好地耐受治疗[9]。灵芝是一种著名的中药材，能够促进白细胞活性、增强免疫细胞数量和功能，进而抑制肿瘤细胞生长[10];灵芝在缓解肿瘤患者疼痛、疲劳、失眠等症状，提高生存质量方面也作用明显[11]。灵芝的有效成分包括多糖、三萜等，其中灵芝多糖可通过对肠道菌群的调节作用上调巨噬细胞活性，加速自噬体形成，改善结直肠癌患者病情[12]。

本研究中，灵芝多糖不同剂量组的细胞凋亡率均较对照组明显提升，且随着灵芝多糖剂量的增加抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用越发明显，随着灵芝多糖剂量的增加列腺癌细胞活性氧水平明显升高，谷胱甘肽水平明显降低。活性氧是一类含氧自由基的总称，在细胞中作为信号分子调节许多细胞功能，其主要由细胞色素氧化酶、黄素氧化酶和烷化酶等产生，过量的活性氧会导致氧化应激从而破坏DNA、蛋白质、脂质，导致细胞死亡或功能障碍[13]。适量的活性氧在一定程度上可以抑制癌细胞的增殖和生长、促使细胞凋亡，部分化疗药物和放疗可通过增加活性氧的水平、诱导肿瘤细胞凋亡来发挥治疗作用[14]。谷胱甘肽是一种由3个氨基酸(谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸)组成的小分子肽，在细胞内起着重要的抗氧化和还原剂作用，是最重要的天然抗氧化剂之一[15]。谷胱甘肽能够清除细胞内活性氧等自由基，减少氧化应激对细胞的损伤；胱氨酸是谷胱甘肽的前体氨基酸，细胞内谷胱甘肽的水平降低可能会导致胱氨酸耗尽，进而激活细胞凋亡；谷胱甘肽还参与细胞增殖、分化、迁移等多种信号转导途径，其代谢异常可能与肿瘤的发展有关[16]。

GCLC是一种关键酶，负责催化甘氨酸和谷氨酸合成谷胱甘肽，在肿瘤细胞中其表达通常增加以应对氧化应激和细胞内还原环境的失衡[17]。GCLC高表达有助于保护肿瘤细胞免受自由基和其他有害分子损伤，促进细胞生存和增殖[18]。GCLM负责催化谷胱甘肽分解，在肿瘤细胞中其表达通常升高，可能与细胞内还原环境的失衡或受到抑制有关[19]。TXNRD1参与调节谷胱甘肽循环中的醌还原反应，在肿瘤细胞中其表达通常增加，以促进谷胱甘肽循环和保护细胞免受氧化应激的影响；TXNRD1高表达有助于维持细胞内还原环境，促进细胞的生存和增殖[20]。结合本研究结果可知，灵芝多糖可通过抑制抗氧化因子GCLC、GCLM、TXNRD1表达减少谷胱甘肽生成，进而促进前列腺癌细胞中活性氧产生，诱导细胞凋亡，抑制前列腺癌病情进展。

参考文献:

[1]李星,曾晓勇.中国前列腺癌流行病学研究进展[J].肿瘤防治研究,2021;48(1):98-102.

[2]张明,杨玉珍,陈晓玉,等.老年与中青年前列腺癌患者的临床病理特点分析[J].海南医学,2022;33(13):1664-7.

[3]郭长城,杨斌,琚建军,等.T4期前列腺癌手术治疗的疗效分析[J].中华泌尿外科杂志,2021;42(9):700-5.

[4]王涛,李玉兵,求旦旦,等.前列腺癌的现代中医药治疗策略探讨[J].广州中医药大学学报,2022;39(1):207-13.

[5]罗云,陈霖,张雪涟,等.灵芝三萜类成分药理活性研究进展[J].中国药理学通报,2021;37(9):1185-8.

[6]邱海波,曹素梅,徐瑞华.基于2020年全球流行病学数据分析中国癌症发病率､死亡率和负担的时间趋势及与美国和英国数据的比较[J].癌症,2022;41(4):165-77.

[7]韩苏军,刘飞,邢念增.1988—2015年中国肿瘤登记地区前列腺癌发病趋势分析[J].中华泌尿外科杂志,2022;43(1):51-5.

[9]崔涛,王守岗,关晓辉,等.桦褐孔菌多糖对环磷酰胺中毒小鼠体内抗氧化活性的影响[J].北华大学学报(自然科学版),2021;22 (3):329-32.

[10]安娜,黄芳敏,王健辉,等.四种中药不同药性与药理作用关系研究[J].陕西中医,2021;42(10):1349-53.

[11]冯娜,岳亚文,程池露,等.灵芝菌丝体三萜及其药理活性的研究进展[J].菌物学报,2022;41(9):1341-53.

[12]刘伟志,洪伟,李金龙.灵芝多糖对结直肠癌细胞的调控作用研究[J].实用药物与临床,2021;24(8):673-7.