2022年中国乳腺癌新发病例数预计高达42万，位居女性总体癌症发病率首位[1]。近年来，抗肿瘤免疫已成为肿瘤研究的热点，而淋巴细胞作为抗肿瘤免疫中的关键成员得到广泛关注[2,3,4]。有研究显示，免疫细胞的数量和比例随着肿瘤的发生、生长和转移发生着动态变化，对机体免疫状态及肿瘤进程的评估有极其重要的意义[5,6]。双阴性T(double-negative T,DNT) 细胞是一类免疫调节性T细胞，其表面不表达CD4、CD8抗原，占正常人外周血T淋巴细胞的3%～5%,具有天然免疫和适应性免疫功能[7,8]。随着研究进展，DNT细胞不仅在肿瘤治疗中有新突破[9,10],作为生物标志物在肿瘤诊断中也得到广泛关注[11,12]。然而，目前DNT细胞对乳腺癌诊断及与临床病理特征相关性的报道较少。本研究收集乳腺癌患者、乳腺良性肿瘤患者及健康体检者的相关临床资料，采用流式细胞术检测并分析T淋巴细胞亚群及DNT细胞百分比，探讨免疫细胞在乳腺癌患者中的表达情况以及在乳腺癌筛查中的诊断价值。

1、对象与方法

1.1 病例选择及一般资料

采用病例对照研究方法，回顾性选取2021-09-30-2023-04-18中国人民解放军联勤保障部队第九六〇医院甲状腺乳腺外科收治的新发乳腺癌患者82例作为乳腺癌组。纳入标准：(1)女性；(2)原发性乳腺癌；(3)病理确诊为乳腺癌；(4)术前患者未行新辅助治疗。排除标准：(1)合并其他肿瘤；(2)合并免疫系统疾病；(3)患者临床资料及病理结果缺失。选取同期入院乳腺良性肿瘤患者88例为乳腺良性肿瘤组(乳腺纤维腺瘤69例，导管内乳头状瘤19例),健康体检者81名为健康组。本研究通过解放军第九六〇医院科研伦理委员会批准(2022104),研究对象均知情同意。

1.2 观察指标

收集术前年龄、绝经情况、高血压、糖尿病、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)、糖类抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)、糖类抗原15-3(carbohydrate antigen 15-3,CA15-3)、病理类型、临床分期[美国癌症联合委员会分期标准(第8版)]以及雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)、细胞核增殖相关抗原Ki-67表达水平，外周血T淋巴细胞亚群百分比等信息。

1.3 主要试剂与仪器

CD45/CD4/CD8/CD3检测试剂盒、溶血剂(OptiLyse C裂解液)和FC500流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特有限公司，CEA测定试剂盒、CA125检测试剂盒、CA15-3测定试剂盒和罗氏e601电化学发光全自动免疫分析系统均购自德国罗氏诊断公司。

1.4 试验方法

1.4.1 样本采集与处理

采集健康组、乳腺良性肿瘤组、乳腺癌组空腹静脉全血2 mL,置于含有乙二胺四乙酸抗凝剂的真空采血管中，混匀，标本在采集后24 h内处理。

1.4.2 流式细胞仪检测样本前处理

采用流式细胞术分析外周血DNT细胞及T淋巴细胞亚群在各组间的表达情况。(1)抗体标记：取100 μL抗凝全血于流式细胞管中，加入10 μL单克隆抗体(CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5);(2)避光孵育：混匀，避光放置20 min; (3)溶血剂裂解红细胞：向流式细胞管内加入1 mL溶血剂，混匀后避光静置10 min, 1 500 r/min离心5 min(r=10 cm),弃去上清；(4)洗涤：流式细胞管内加入1 mL生理盐水，1 500 r/min离心5 min(r=10 cm),弃去上清，加入生理盐水重悬细胞，混匀；(5)使用FlowJo v10.8进行流式细胞数据分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0进行统计学处理。测定数据采用夏皮洛-威尔克方法进行正态分布检验：符合正态分布的计量资料以描述，2组间均值差异比较采用独立样本t检验，多组间均值差异比较采用单因素方差分析；不符合正态性的数据以M(P25,P75)描述，2组间中位数差异比较采用Mann-Whitney U检验，多组间中位数差异比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。无序计数资料用例数(%)描述，采用χ2检验。运用先单因素后多因素的logistic回归分析筛选导致乳腺癌的影响因素，通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析其诊断效能。检验水准α=0.05(双尾)。

2、结果

2.1 一般资料

健康组、乳腺良性肿瘤组、乳腺癌组在中位年龄、月经情况、高血压及糖尿病上差异均无统计学意义(P>0.05),肿瘤标志物CEA、CA125及CA15-3差异均有统计学意义，P<0.001(表1)。乳腺癌组中具有各临床、病理等特征的病例数及其占比见图1。

2.2 T淋巴细胞亚群及DNT细胞百分比分析

乳腺癌组CD4+ T细胞百分比、CD4+/CD8+比值及DNT细胞百分比均高于健康组，乳腺癌组DNT细胞百分比高于乳腺良性肿瘤组，乳腺良性肿瘤组CD4+ T细胞百分比、CD4+/CD8+比值均高于健康组，差异均有统计学意义，P<0.05。见表2。

表1 3组一般资料比较

图1 乳腺癌组中具有各临床和病理等特征的病例数及其占比(n=82)  

表2 3组T淋巴细胞亚群及双阴性T细胞百分比比较[M(P25,P75)]

2.3 T淋巴细胞亚群及DNT细胞百分比与乳腺癌患者临床特征关系

乳腺癌病理分型中CD3+ T细胞百分比、CD4+ T细胞百分比差异均有统计学意义，P<0.05;淋巴转移者CD3+ T细胞百分比、CD4+ T细胞百分比和DNT细胞百分比均低于无转移者，差异有统计学意义，P<0.05;临床分期中乳腺癌晚期 (Ⅲ+Ⅳ期) 者CD3+ T细胞百分比、CD4+ T细胞百分比和DNT细胞百分比均低于早期 (Ⅰ+Ⅱ期) 者，差异均有统计学意义，P<0.05;Ki-67高表达者的CD4+ T细胞百分比低于低表达者，差异有统计学意义，P<0.05;乳腺癌分子分型中CD3+ T细胞百分比、DNT细胞百分比差异均有统计学意义，P<0.05。见表3。

2.4 二元logistic回归分析乳腺癌发生的影响因素

单因素分析结果显示，CD4+ T细胞百分比、CD4+/CD8+、DNT细胞百分比、CEA、CA125和CA15-3是对乳腺癌发生有影响的关联因素，均P<0.05。将以上指标用逐步向后法进行多因素logistic回归分析，结果显示，CD4+ T细胞百分比、DNT细胞百分比、CEA、CA125和CA15-3是乳腺癌发生的影响因素，差异均有统计学意义，均P<0.05。见表4。

2.5 ROC曲线分析

基于多因素logistic回归分析的结果，将感兴趣的DNT细胞百分比和临床常用的肿瘤标志物CEA、CA125和CA15-3纳入ROC曲线，评估各指标在乳腺癌中的诊断效能。结果显示：外周血DNT细胞百分比联合肿瘤标志物(CEA、CA125、CA15-3)评估健康组和乳腺癌组的灵敏度为80.49%,特异度为86.42%(表5);评估乳腺良性肿瘤组和乳腺癌组的灵敏度为74.39%,特异度为80.68%(表6)。外周血DNT细胞百分比、CEA、CA125、CA15-3、CEA+CA125+CA15-3、DNT+CEA+CA125+CA15-3评估健康组和乳腺癌组时ROC曲线下面积分别为0.810、0.702、0.714、0.727、0.812和0.897(表5和图2);评估乳腺良性肿瘤组和乳腺癌组时曲线下面积为0.739、0.684、0.665、0.700、0.774和0.838(表6和图3)。

表3 T淋巴细胞亚群和双阴性T细胞百分比与乳腺癌临床特征的关系

表4 影响健康体检者与乳腺癌发生因素二元logistic回归分析结果

表5 外周血双阴性T细胞联合肿瘤标志物对健康组和乳腺癌组诊断价值比较

图2 外周血双阴性T细胞联合肿瘤标志物诊断乳腺癌与健康者的灵敏度、特异度及曲线下面积

3、讨论

肿瘤的发生发展与机体的免疫状态密切相关，T淋巴细胞亚群的数量和比例是评价机体免疫状态的重要指标[13]。机体在抗肿瘤免疫过程中，通常以T淋巴细胞为核心与肿瘤抗原发生相互作用[14,15]。随着对T细胞亚群的不断探索，发现DNT(CD3+CD4-CD8-)细胞在肿瘤免疫中起着重要作用。DNT细胞在不同病理条件下影响先天性和获得性免疫系统，并且在不同的肿瘤微环境和肿瘤类型中发挥着促进肿瘤或抑制肿瘤的作用[8]。一般认为DNT细胞起源于骨髓中的祖细胞，在胸腺中成熟和选择后转移到外周循环。但也有研究认为，DNT细胞可由外周成熟的T细胞产生[16]。已有研究报道，在多种恶性肿瘤，如肺、胃、肝脏及肠道恶性肿瘤中均发现外周血DNT细胞比例显著增加[17],在恶性胸腔积液中也发现DNT细胞数量显著增加[18]。本研究发现，相比健康组和乳腺良性肿瘤组，乳腺癌患者外周血中DNT细胞显著增高，提示DNT细胞可能在乳腺癌中发挥重要作用。另外，本研究发现乳腺癌组外周血中CD4+T细胞及CD4+/CD8+比值与健康组相比均增高，与报道的结果相符[19,20],这些结果均说明，T细胞亚群在乳腺癌中发挥重要作用，有望作为乳腺癌的诊断指标。

表6 外周血双阴性T细胞联合肿瘤标志物对乳腺良恶性肿瘤诊断价值比较

为了进一步探究DNT细胞及相关淋巴细胞与乳腺癌的关系，本研究采用乳腺癌的常用临床特征(病理分型、肿瘤大小、淋巴转移、临床分期、分子分型)来评估乳腺癌患者的疾病状态。乳腺癌病理分型不同，其免疫互作机制也不尽相同[21]。本研究发现，CD3+T、CD4+T细胞百分比在乳腺癌的病理分型中存在差异，而DNT细胞在分子分型中差异有统计学意义。有报道显示，与传统的病理分型相比，分子分型能够更好地反映肿瘤的生物学行为，对于指导治疗和判断预后起重要作用[22]。因此认为相比CD4+T等细胞亚群，DNT细胞可以更好反映乳腺癌患者的疾病状态和评估预后。此外，本研究结果显示CD3+ T、CD4+ T及DNT细胞在乳腺癌淋巴转移及临床晚期中显著降低。有相关报道表明，淋巴转移的乳腺癌更易利用调节性T细胞抑制抗肿瘤T细胞反应，以便逃避免疫监视。并且伴随着临床分期增加，晚期患者免疫抑制更加明显[23,24]。因此，推测未发生淋巴结转移及临床早期时乳腺癌患者产生的免疫作用更加明显，而当乳腺癌逐步发生淋巴结转移进入临床晚期时，免疫功能受到明显抑制。Ki-67作为肿瘤细胞增殖的分子标志物，常用来判断肿瘤恶性程度及预后[25]。本研究结果发现，高表达的Ki-67中CD4+ T细胞降低，进一步表明CD4+ T细胞与乳腺癌疾病状态和严重程度的相关关系。

女性早期乳腺癌的发现主要依靠筛查措施，目前国内外癌症权威机构推荐最常用的筛查措施是乳腺X射线摄影[26,27,28],但乳腺X射线摄影在区分良恶性病变方面的灵敏度和特异度有限，特别是存在致密型乳腺时[29]。另外，常用的乳腺癌血清肿瘤标志物如CEA、CA125和CA15-3并不理想，已有研究表明CA15-3和CEA的阳性率较低[30,31]。有研究者采用DNT细胞联合CEA后，将肺癌检出的灵敏度和特异度分别提高至90.8%和98.9%[11],而本课题组前期采用这2种指标联合检测也显著提高了结直肠癌的诊断价值[13]。另外Imam等[32]报道，在甲状腺细针穿刺标本中，DNT细胞百分比可作为诊断甲状腺癌的免疫基因组标志物。本研究通过多因素回归分析发现DNT细胞、CEA、CA125和CA15-3均是乳腺癌发生的影响因素，ROC曲线结果提示，DNT细胞单独及联合CEA、CA125和CA15-3检测乳腺癌均具有一定的诊断效能，并且在鉴别乳腺良恶性肿瘤上具有参考价值。

本研究虽严格按照纳入及排除标准控制组间年龄等混杂因素，但因样本量小，且联合诊断仅局限于血清学指标，因此结论具有一定的局限性。后期通过加大样本量并联合影像学检查，探讨多学科联合检测对乳腺癌的诊断价值。

综上所述，本研究通过多组间比较发现乳腺癌患者DNT细胞及CD4+ T淋巴亚群比例显著增高，并且与乳腺癌的临床病理特征存在统计学意义的关联。通过logistic回归及ROC曲线分析发现，DNT细胞联合肿瘤标志物能够明显提高乳腺癌诊断价值，有望作为诊断乳腺癌的辅助指标，为临床提供新思路。

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基金资助:山东省自然科学基金面上项目(ZR2021MC137);

文章来源:钟振杰,武静,朱惠茹,等.双阴性T细胞和T淋巴细胞亚群在乳腺癌中表达特征及其诊断价值[J].中华肿瘤防治杂志,2024,31(08):492-499.