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微小RNA-124对乳腺癌细胞凋亡和侵袭的影响及相关作用机制研究

2025-02-14 78 上传者：管理员

摘要：目的分析微小RNA-124(miR-124)对乳腺癌细胞凋亡、侵袭的影响及相关作用机制。方法研究起止时间：2020年12月—2023年12月。将乳腺癌MCF-7细胞株常规培养后分为空白组、上调组、下调组。空白组加入常规细胞培养液进行空白处理，下调组(乳腺癌MCF-7细胞+Hsa-miR-124 mimics NC)作为阴性对照，上调组(乳腺癌MCF-7细胞+mimics上调miR-124)进行转染处理。检测各组细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力及磷脂酰肌醇-3(PI3K)/蛋白激酶(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路蛋白表达量。结果 miR-124 mRNA在乳腺癌组织中的表达量为(0.84±0.12),低于在癌旁组织中的表达量(1.96±0.53),差异有统计学意义(t=7.059,P<0.05)。空白组、上调组、下调组miR-124 mRNA表达量分别为(0.86±0.21)、(1.53±0.52)、(0.57±0.15)。与空白组相比，上调组miR-124 mRNA表达量升高，下调组miR-124 mRNA表达量降低(均P<0.05)。与上调组相比，下调组miR-124 mRNA表达量降低(P<0.05)。空白组、下调组、上调组细胞凋亡率、增殖率比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与下调组相比，上调组细胞凋亡率上升，增殖率下降(均P<0.05)。空白组、下调组、上调组细胞迁移数、侵袭数比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与下调组相比，上调组细胞迁移数、侵袭数均下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与空白组相比，下调组细胞迁移数、侵袭数均升高，上调组细胞迁移数、侵袭数均下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)。空白组、下调组、上调组PI3K、AKT、mTOR、Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表达量比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 miR-124在乳腺癌中低表达，上调其表达后可促进乳腺癌细胞凋亡，抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭，作用机制可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路失活相关。

关键词：
乳腺癌细胞
微小RNA-124
细胞侵袭
细胞凋亡
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乳腺癌多发于女性,也是导致女性死亡的主要原因。目前,全世界范围内乳腺癌的发病率和死亡率均呈现逐年递增的趋势,严重威胁患者的生命安全[1]。临床治疗乳腺癌以早期手术、中后期放化疗为主,但仍有部分患者5年生存率较低,可能与乳腺癌细胞异常增殖相关,目前乳腺癌的发病机制并不明确[2]。微小RNA ( miRNA)属于一种长度较短的非编码RNA分子, miR-124为此家族成员之一,在多种恶性肿瘤中异常表达,参与恶性肿瘤的发生、发展,在乳腺癌中低表达[3]。基于此,本研究旨在分析miR124对乳腺癌细胞凋亡、侵袭的影响及相关作用机制,以明确miR-124是否与乳腺癌细胞生物学行为相关,为临床诊治提供参考。

1、资料与方法

1. 1资料来源

研究起止时间: 2020年12月—2023年12月。研究细胞:从南京赛泓瑞生物科技有限公司购买人乳腺癌MCF-7细胞株,已经通过医院伦理委员会审批。主要试剂: Hsa -miR- 124 mimicsNC、Hsa-miR-124 mimics均购自广州锐博生物技术有限公司;小鼠抗大鼠磷脂酰肌醇-3 (PI3K)抗体购自上海钰博生物科技有限公司;小鼠抗大鼠蛋白激酶(AKT)抗体购自上海杰美基因医药科技有限公司;兔抗大鼠哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗体购自北京博尔西科技有限公司;兔抗人Caspase-3抗体购自上海恒斐生物科技有限公司;兔抗人Caspase-9抗体购自艾美捷科技有限公司;兔抗大鼠Bcl-2抗体购自北京索莱宝科技有限公司;小鼠抗大鼠Bax抗体购自上海信帆生物科技有限公司。

1. 2方法

1. 2. 1检测

miR-124在乳腺癌中的表达取医院病理科保存的10例乳腺癌患者的癌组织、癌旁组织,采用RT-PCR法测定miR-124表达情况,取乳腺癌及癌旁组织,采用Trizol法提取细胞总RNA,检测RNA含量,应用Takara逆转录试剂盒得到cDNA,采用Primer 5. 0软件设计引物序列,采用2-△△Ct法计算相对表达量。反应体系:上下游引物0. 4μl、cDNA模板1μl、SYB Green 10μl ,加20μl蒸馏水。反应条件:预变性1 min 95℃, 30 s 94℃, 30 s 60℃,30 s 72℃, 5 min 72℃,循环30次。miR-124引物序列:上游引物5′-TTTTAAGGCACGCGGTG-3′,下游引物5′-TTTGGCACTAGCACATT-3′。内参基因U6引物序列:上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1. 2. 2细胞培养

在37℃ 、5% CO2、饱和湿度环境条件下,取10%胎牛血清、RPMI 1640双抗培养基培养人乳腺癌MCF-7细胞,隔3 d进行1次更换,细胞融合度为70% ~80%时进行培养传代。

1. 2. 3细胞转染

乳腺癌MCF-7细胞取对数生长期,分为空白组(不给予任何处理的乳腺癌MCF-7细胞)、下调组(乳腺癌MCF-7细胞+Hsa-miR-124mimics NC)、上调组(乳腺癌MCF - 7细胞+mimics上调miR - 124 ),设复孔,加细胞悬液,浓度为1×105个/ ml,对数生长期为培养终止期限。后续实验中每个复孔检测5次,实验重复2次,共10次。

1. 2. 4 miR-124转染情况鉴定

转染结束后,采用RT-PCR法检测miR-124转染情况,方法同1. 2. 1。

1. 2. 5细胞增殖检测

采用MTT比色法检测细胞增殖情况,培养后,设置浓度至3×104个/ ml,接种于96孔板,每孔加细胞悬液200μl, 5% CO2、37℃环境下培养24、48、72 h,加MTT试剂10μl,取酶标仪,测定570 mm波长处OD值,计算各组细胞增殖率。细胞增殖率= (细胞组OD值/参照组OD值)×100%。

1. 2. 6细胞凋亡检测

采用TUNEL法检测细胞凋亡率,通过荧光显微镜观察细胞凋亡数,细胞核经洗涤、DAPI染色封片后,呈阳性(绿色荧光)和阴性(蓝色荧光),计算细胞凋亡指数,计算3次取平均值。细胞凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1. 2. 7细胞侵袭能力检测

采用Transwell小室检测各组细胞侵袭能力, Transwell小室置于培养板,于上室接种细胞,于下室接种100 ng / ml白细胞介素- 8(IL-8), 24 h后下室加100μg / ml TMP溶液,孵育24 h,擦除上室微孔细胞, PBS洗涤3次, 3 min /次,4%多聚甲醛溶液固定,处理15 min,苏木晶染色,10 min, PBS洗涤,于显微镜下观察各组乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力。1. 2. 8细胞PI3K/ AKT / mTOR信号通路蛋白表达量检测采用Western Blot法检测细胞PI3K/ AKT /mTOR信号通路蛋白表达量。离心细胞10 min,取上清,采用BCA法检测蛋白定量,取蛋白50μg,加入2×SDS凝胶缓冲液, 100℃ 持续5 min,促进蛋白变性。凝胶电泳、转膜,取膜, 4℃ 环境,固定在5%脱脂牛奶中封闭1 h,取0. 05% ~ 0. 1% TBST稀释一抗( PI3K、AKT、Caspase - 9、Bcl - 2、Caspase - 3、Bax、mTOR一抗为1∶1 000), 4℃ 过夜孵育储存,取0. 05% ~ 0. 1% TBST,洗膜3次, 5 min /次,取0. 05% ~0. 1% TBST稀释二抗(1∶10 000),摇动孵育1 h,取TBST,洗膜3次, 5 min /次,加DAB显色,定量分析蛋白表达情况,内参为GAPDH。

1. 3统计学分析

使用SPSS 19. 0统计软件包分析数据。计量资料采用(x±s)描述,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用F检验。P<0. 05为差异有统计学意义。

2、结果

2. 1 miR- 124在乳腺癌中的表达情况

miR - 124mRNA在乳腺癌组织中的表达量为( 0. 84±0. 12),低于在癌旁组织中的表达量(1. 96±0. 53),差异有统计学意义(t = 7. 059, P<0. 05)。

2. 2各组转染情况比较

空白组、上调组、下调组miR - 124 mRNA表达量分别为( 0. 86±0. 21 )、(1. 53±0. 52)、(0. 57±0. 15)。与空白组相比,上调组miR - 124 mRNA表达量升高,下调组miR - 124mRNA表达量降低(t = 3. 788, 3. 557,均P<0. 05)。与上调组相比,下调组miR-124 mRNA表达量降低(t = 5. 620, P<0. 05),说明miR-124转染成功。

2. 3各组细胞凋亡率、增殖率比较

空白组、下调组、上调组细胞凋亡率、增殖率比较,差异均有统计学意义(均P<0. 05)。与下调组相比,上调组细胞凋亡率上升,增殖率下降(均P<0. 05)。见表1、图1。

2. 4各组细胞迁移、侵袭情况比较

空白组、上调组、下调组细胞迁移数、侵袭数比较,差异均有统计学意义(均P<0. 05)。与下调组相比,上调组细胞迁移数、侵袭数均下降( t = 20. 624, 19. 137,均P<0. 05)。与空白组相比,下调组细胞迁移数、侵袭数均升高(t = 9. 503, 11. 745,均P<0. 05),上调组细胞迁移数、侵袭数均下降( t = 15. 825, 15. 155,均P<0. 05)。见表2、图2、图3。

2. 5各组细胞PI3K/ AKT / mTOR信号通路蛋白表达量比较

3组PI3K、AKT、mTOR、Caspase - 3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表达量比较,差异均有统计学意义(均P<0. 05)。见表3、图4。

表1各组细胞凋亡率、增殖率比较

图1各组细胞凋亡TUNEL图

表2各组细胞迁移、侵袭情况比较

图2各组细胞迁移能力比较

图3各组细胞侵袭能力比较

表3各组细胞PI3K/ AKT/ mTOR信号通路蛋白表达量比较

图4 PI3K/ AKT/ mTOR信号通路蛋白表达Western Blot图

3、讨论

随着经济的不断发展,现代女性的生活压力增加,且在饮食、环境等多种因素的共同作用下,乳腺癌的发病率和死亡率均较高[4]。临床虽然已经探索出多种治疗乳腺癌的手段,如介入、手术、分子靶向治疗等,但患者生存周期仍较短,预后大多不良,可能与乳腺癌治疗过程中癌细胞处于增殖、凋亡失衡状态有关[5]。目前,乳腺癌的发病机制并不完全明确,且缺乏特异性诊治靶点。基于此,本研究分析miR-124对乳腺癌细胞生物学行为的影响,并进一步研究其相关作用机制,为临床选择乳腺癌诊治靶点提供参考。miRNA在细胞增殖、分化、代谢等多个过程中具有重要的调节作用,属于一类新的抑癌基因/癌基因,表达水平与机体病变情况相关,表达失衡会诱导细胞癌变,参与多种恶性肿瘤的发生,如肺癌、胃癌、结肠癌等[6-8]。

乳腺癌的发生与多个miRNA表达失衡相关,包括miR - 503、miR - 141、miR - 100等,均参与乳腺癌的发生、发展及预后恢复过程[9]。miR- 124属于一种保守性较高的miRNA,可编码3个基因,分别位于8p23. 1、8q12. 3、20q13. 33位点上,其所编码的基因启动子区均包含CpG岛,出现甲基化现象后可导致其自身沉默,使表达失衡,最终诱导恶性肿瘤的发生[10-12]。任晖等[13]研究显示:miR-124在乳腺癌患者中低表达。

本研究显示:乳腺癌组织中miR-124表达量较低,与上述研究结果一致。基于以上研究,本研究构建miR-124下调与上调载体,结果显示miR-124上调后乳腺癌细胞侵袭率、增殖率、迁移率均下降,凋亡率上升,提示miR-124低表达参与乳腺癌的发生、发展,上调后能抑制乳腺癌细胞增殖过度,促进凋亡,对阻止疾病恶化发挥明显作用。PI3K/ AKT / mTOR信号通路与恶性肿瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期分布、细胞迁移、细胞侵袭、肿瘤新生血管生成相关,对恶性肿瘤发生发展、治疗及预后转归具有重要意义[14]。近年研究[15-16]显示:PI3K/ AKT / mTOR信号通路与乳腺癌发生密切相关,在乳腺癌发生过程中此信号通路的活性高达70%。在PI3K/ AKT / mTOR信号通路中, AKT处于核心位置,约由480个氨基酸组成,属于一种在进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,当其被活化后会在细胞膜上生成PIP3,之后PIP3与AKT的N端PH结构域特异性结合,使AKT从胞质转移至胞膜,启动下游底物,抑制细胞凋亡,促进细胞增殖及肿瘤新生血管生成[17-19]。mTOR属于PI3K、AKT的下游作用靶点,当PI3K、AKT被活化后,会激活mTOR,经一系列的反应过程,促使肌动蛋白细丝发生重构,最终实现促进恶性肿瘤细胞迁移、侵袭的作用[20-21]。本研究显示:乳腺癌细胞的生物学行为受上调miR124影响,上调miR-124作用于PI3K/ AKT / mTOR信号通路,可使其失活,抑制细胞增殖,促进凋亡。

综上所述, miR-124在乳腺癌中低表达,其作用机制可能与PI3K/ AKT / mTOR信号通路失活有关,上调其表达后可抑制乳腺癌细胞侵袭、迁移,促进乳腺癌细胞凋亡。

参考文献:

[3]钟阿红,许希中,余进进,等. miR-124在肿瘤研究中的进展[J].基础医学与临床, 2015, 35 (4): 531-535.

[6]刘长琳,胡金芳,陈思羽,等. miRNA对肿瘤微环境中免疫细胞的调控作用[J].医学综述, 2020, 26 (11): 2156-2163.

[7]杨鑫苗,张永强. miRNA调控实体肿瘤发生发展机制研究进展[J].现代肿瘤医学, 2020, 28 (9): 1587-1589.

[8]杨鑫苗,张永强. miRNA在实体肿瘤诊断及治疗中的研究进展[J].癌症进展, 2019, 17 (10): 1117-1119, 1151.

[9]刘晶晶,周冬冬,张瑾.环状RNA在乳腺癌中的研究进展[J].天津医药, 2020, 48 (4): 333-337.

[13]任晖,欧剑锋,赵庆丽. miR-124在乳腺癌中的表达及其作用机制研究[J].中国肿瘤临床, 2015, 42 (20): 1012-1017.

文章来源:李丽燕,郑旭旭.微小RNA-124对乳腺癌细胞凋亡和侵袭的影响及相关作用机制研究[J].中国妇幼保健,2025,40(04):732-735.