首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 肾癌/肾细胞癌论文 > 帕比司他靶向ARL4C抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究

帕比司他靶向ARL4C抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究

2024-06-07 36 上传者：管理员

摘要：目的探讨帕比司他通过靶向ADP核糖基化因子样蛋白4C(ARL4C)对肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法将肾癌细胞株786-O分为空白组(用磷酸盐缓冲溶液干预)、实验组(用50 nmol·L-1帕比司他干预)、空载体组(先转染空载体，然后用磷酸盐缓冲溶液干预)、过表达组(先转染ARL4C过表达载体，然后用磷酸盐缓冲溶液干预)、联合组(先转染ARL4C过表达载体，然后用50 nmol·L-1帕比司他干预)。用噻唑蓝法和划痕实验检测细胞的增殖、迁移和侵袭水平，用酶标仪检测细胞内胆固醇水平，用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测ARL4C mRNA和蛋白的表达水平。结果空白组、实验组、空载体组、过表达组和联合组的细胞增殖率分别为(100.00±0)%、(61.08±5.82)%、(101.22±5.92)%、(121.94±6.63)%和(101.78±6.87)%,迁移率分别为(44.59±2.49)%、(29.02±2.09)%、(42.75±2.42)%、(54.19±3.05)%和(41.91±2.75)%,侵袭能力分别为(264.50±6.52)、(182.70±5.83)、(257.80±7.91)、(322.40±8.27)和(266.80±8.15)个，胆固醇水平分别为(72.48±6.21)、(36.48±3.44)、(73.89±5.91)、(89.21±8.89)和(73.06±6.92)mmol·L-1,ARL4C mRNA相对表达水平分别为1.23±0.22、0.24±0.08、1.27±0.25、1.67±0.38和1.27±0.25,ARL4C蛋白相对表达水平分别为1.06±0.03、0.17±0.04、1.03±0.05、1.37±0.18和1.05±0.08。实验组的上述指标和空白组比较，过表达组的上述指标与空白组和空载体组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论帕比司他通过下调ARL4C表达，降低细胞内胆固醇水平，从而抑制肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭水平。

关键词：
ADP核糖基化因子样蛋白4C
帕比司他
细胞增殖
肾癌
胆固醇
加入收藏

近年来，表观遗传学研究发现，抑制组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylase, HDAC)能提高组蛋白乙酰化水平，上调细胞周期阻滞和/或细胞凋亡相关基因的转录活性，进而诱导恶性细胞凋亡[1]。帕比司他是一种新型组蛋白去乙酰化酶抑制药，在急性髓系白血病中有很好的抗肿瘤活性[2],其与依维莫司联合使用可诱导肾癌细胞凋亡[3]。此外，帕比司他能通过增加微管蛋白乙酰化，促进细胞内胆固醇流出，而ADP核糖基化因子样蛋白4C(ADP ribosylation like factor 4C,ARL4C)可通过干扰肌动蛋白聚合，抑制细胞内胆固醇运输[4]。研究显示，ARL4C高表达会促进肿瘤耐药，其可能是通过激活自噬帮助肿瘤细胞在缺氧环境中生存和转移[5],而ARL4C敲除则显著降低了肾癌细胞的侵袭能力[6]。本研究旨在探讨帕比司他抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制是否与靶向ARL4C相关。

一、材料与方法

1 材料

细胞株肾癌细胞株786-O,购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

药品与试剂帕比司他，规格：每瓶10 mg, 纯度：99%,批号：S1030,美国Selleck公司生产。噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT),武汉赛维尔生物科技有限公司生产；胆固醇定量试剂盒，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产；PrimeScript RT试剂盒，北京格瑞通达科技有限公司生产；SYBR Premix Ex Taq试剂盒，南通飞宇生物科技有限公司生产；ARL4C过表达载体，北京擎科生物科技有限公司合成。

仪器SpectraMax iD3酶标仪，上海美谷分子仪器有限公司产品；Gentier X3实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)仪，西安天隆科技有限公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养[6]6]

将786-O细胞株置于DMEM中培养，在培养基中添加10%胎牛血清和0.3%青霉素/链霉素，所有细胞均置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，按1∶3比例传代，取对数生长期细胞进行后续实验。

2.2 细胞分组与给药方法

将实验分为空白组(用磷酸盐缓冲溶液干预)、实验组(用50 nmol·L-1帕比司他干预[7])、空载体组(先转染空载体，然后用磷酸盐缓冲溶液干预)、过表达组(先转染ARL4C过表达载体，然后用磷酸盐缓冲溶液干预)、联合组(先转染ARL4C过表达载体，然后用50 nmol·L-1帕比司他干预)。

2.3 MTT法检测细胞增殖水平[4]4]

将786-O细胞密度调整为5×103 cell·mL-1,并接种于96孔培养板，按“2.2”的方法进行分组和处置，每组设置5个复孔，培养48 h后，用磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞2次，加入MTT,孵育2 h。每孔加入二甲基亚砜100 μL溶解蓝色甲臜晶体，在550 nm处读取光密度(optical density, OD)值，以空白组为对照，计算细胞增殖率(%)。

2.4 细胞迁移和侵袭的检测[5]5]

将786-O细胞按“2.2”的方法进行分组和处置48 h, 调整细胞密度为5×103 cell·mL-1,接种于6孔板，待细胞贴壁后用1 mL移液枪枪头在孔底划线，清洗划下的细胞后加入无血清培养基中培养24 h, 在显微镜下观察并拍照，计算细胞迁移率。同法操作，吸取细胞悬液100 μL,加入Transwell小室上腔，培养20 h, 用甲醛固定和结晶紫染色，在100倍显微镜下拍照并计数各组穿过膜的细胞数量来表示侵袭水平。

2.5 胆固醇运输水平的检测[5]5]

将786-O细胞按“2.2”的方法进行分组和处置48 h, 每组取1×106个细胞，按文献[5]的方法进行操作，在570 nm处测定OD值，并计算细胞内胆固醇水平，细胞内胆固醇含量越低，则表示细胞胆固醇运输水平越高。

2.6 蛋白质印迹法检测ARL4C蛋白的表达水平[8]8]

将786-O细胞按“2.2”的方法进行分组和处置48 h, 每组取1×106个细胞，用裂解液提取总蛋白，进行蛋白定量。用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再电转移到PVDF膜。在室温下用含5%脱脂奶粉封闭1 h, 在4 ℃与一抗孵育过夜，洗膜后二抗室温孵育1 h, 以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参蛋白，用Image J软件计算各目的条带的相对灰度值。

2.7 实时荧光定量PCR法检测ARL4C mRNA的表达水平[8]8]

将786-O细胞按“2.2”的方法进行分组和处置48 h, 清洗并离心后，每组取1×106个细胞，用RNA快速提取试剂盒提取总RNA,用PrimeScript RT试剂盒和SYBR Premix Ex Taq检测mRNA水平。用GAPDH作为内参，用2-ΔΔCt法定量mRNA的相对表达水平。

3 统计学处理

所有实验至少重复3次。用PRISM7软件进行统计分析。计量资料用

表示，两两比较用t检验。

二、结果

1 帕比司他靶向ARL4C对肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

空白组给予磷酸盐缓冲溶液干预；实验组给予50 nmol·L-1帕比司他干预；空载体组先转染空载体，然后给予磷酸盐缓冲溶液干预；过表达组先转染ARL4C过表达载体，然后给予磷酸盐缓冲溶液干预；联合组先转染ARL4C过表达载体，然后给予50 nmol·L-1帕比司他干预。

与空白组相比，实验组的细胞增殖、迁移和侵袭水平均显著下降(均P<0.05);与空载体组和空白组相比，过表达组的细胞增殖、迁移和侵袭水平均显著上升(均P<0.05),而联合组的细胞增殖、迁移、侵袭水平与空载体组和空白组相比，均无显著性差异(均P>0.05)。结果见表1。

2 帕比司他靶向ARL4C对肾癌细胞胆固醇运输的影响

空白组、实验组、空载体组、过表达组和联合组的细胞内胆固醇水平分别为(72.48±6.21)、(36.48±3.44)、(73.89±5.91)、(89.21±8.89)和(73.06±6.92)mmol·L-1。与空白组相比，实验组的细胞内胆固醇水平显著下降，在统计学上差异有统计学意义(P<0.05);与空白组和空载体组相比，过表达组的细胞内胆固醇水平均显著升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);联合组、空载体组和空白组的细胞内胆固醇水平两两比较，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05)。这说明帕比司他能明显促进肾癌细胞的胆固醇胞外运输水平，过表达ARL4C能拮抗这一效应。

3 帕比司他对肾癌细胞表达ARL4C的影响

空白组、实验组、空载体组、过表达组和联合组的ARL4C mRNA相对表达水平分别为1.23±0.22、0.24±0.08、1.27±0.25、1.67±0.38和1.27±0.25,ARL4C蛋白相对表达水平分别为1.06±0.03、0.17±0.04、1.03±0.05、1.37±0.18和1.05±0.08。与空白组相比，实验组的ARL4C mRNA和蛋白相对表达水平均显著下调(均P<0.05);与空白组和空载体组相比，过表达组的ARL4C mRNA和蛋白相对表达水平均显著上调(均P<0.05);联合组、空载体组和空白组组间的ARL4C mRNA和蛋白相对表达水平比较，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05)。结果见图1。

表1 5组肾癌细胞增殖、迁移和侵袭情况的比较

图1 用蛋白质印迹法检测帕比司他对肾癌细胞中ADP核糖基化因子样蛋白4C(ARL4C)表达的影响

三、讨论

研究发现，ARL4C能促进癌细胞的增殖和转移[9],且与化疗药物的耐药性有关[10]。ISONO等[11]研究显示，ARL4C在肾透明细胞癌中表达升高会导致患者预后不佳，是肾细胞癌患者预后不良的预测性生物标志物。肾癌细胞内Wnt/β-catenin通路激活可上调ARL4C表达，进而上调细胞周期蛋白D1和c-myc的表达，促进癌细胞上皮-间充质转化，从而导致疾病进展。胞内胆固醇进入溶酶体后水解为游离胆固醇，再转运到内质网、细胞膜以发挥功能。YANG等[5]研究显示，卵巢癌细胞ARL4C敲低后会减少胆固醇从溶酶体到内质网的运输，导致溶酶体内胆固醇堆积，进而影响细胞自噬功能，从而逆转卵巢癌细胞的耐药性。在营养缺乏和缺氧环境中，自噬能降解细胞内大分子物质和细胞器为细胞提供营养和物质支持，抑制活性氧和错误折叠蛋白在细胞内积累。帕比司他能通过抑制ARL4C来干扰肾癌细胞的自噬活性，这为帕比司他与其他化疗药物的联合应用提供了理论基础。

本研究提示：帕比司他通过抑制ARL4C表达，从而降低肾癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。本研究不足之处在于对细胞内信号调控研究较少，未能检测帕比司他对Wnt/β-catenin信号通路的影响，应在今后的研究中继续深入。

基金资助:河南省科技攻关指导基金资助项目(232102310516);

文章来源:杨志云,王雪莉,田秀岭.帕比司他靶向ARL4C抑制肾癌细胞增殖､迁移和侵袭的研究[J].中国临床药理学杂志,2024,40(11):1569-1572.