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氯化亚铁溶液建立大鼠外伤性癫痫的造模方法及高压氧治疗研究

2023-12-22 143 上传者：管理员

摘要：目的：皮层注射氯化亚铁溶液建立外伤性癫痫大鼠模型及高压氧治疗对其防治及作用机制。方法：采用大脑皮层注射氯化亚铁建立外伤性癫痫大鼠模型，分模型组、治疗组及正常组进行行为学观察及脑电图监测，取脑组织观察神经细胞形态改变，检测各组样本c-fos mRNA、c-jun mRNA、c-myc mRNA的表达水平。结果：皮层注射氯化亚铁建立外伤性癫痫大鼠模型，操作简单，成功率高，稳定可靠，是值得推广的全新造模方法。该模型中c-fos、c-jun、c-myc均呈现长时程表达。结论：皮层注射氯化亚铁可通过诱导神经细胞凋亡导致癫痫发作。高压氧治疗外伤性癫痫可通过阻断c-jun、c-myc基因介导的细胞凋亡通路而起到治疗效果。

关键词：
外伤性癫痫
早期快反应基因
氯化亚铁
造模
高压氧
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癫痫是一组临床综合征，其特征是反复发作的大脑神经元异常放电，导致突然、短暂的大脑功能失调，表现为运动、感觉、意识、植物神经、精神等不同障碍或兼而有之，按病因分为继发性癫痫(又称“症状性癫痫”)及原发性癫痫。外伤性癫痫(Posttraumatic epilepsy,PTE)是外伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)的常见后遗症，是指由外伤性脑损伤引起的慢性反复发作性癫痫[1]，约占症状性癫痫10%～20%[2]。在我国交通事故伤中，外伤性脑损伤排第二位，大多数幸存者都存在后遗症[3]，且至少有50%的外伤性脑损伤患者在1年内出现癫痫[4]。外伤性脑损伤后出现不明原因的抽搐发作，结合全面的病史、神经系统检查、影像学检查以及脑电图改变可诊断外伤性癫痫[5]。根据伤后第一次癫痫发作的时间，分为即刻癫痫(<24 h)，早期癫痫(1～7天)和晚期癫痫(伤后>1周)[6]。

外伤性癫痫动物模型是指在外伤性脑损伤后出现反复自发性癫痫发作，能够模拟人类PTE脑电图和临床特点，并能维持一定时间的动物模型[7]。多年来，研究者们根据研究目的和PTE发病机制的不同，先后建立了数种PTE动物模型，包括氢氧化铝凝胶模型、皮质底切模型、铁离子注射模型以及侧位液压冲击脑损伤模型等[8,9]。其中，氢氧化铝凝胶模型、皮质底切模型与真正外伤性脑损伤机制相差甚远；侧位液压冲击脑损伤模型于2004年由D'Ambrosio等建立成功，可以很好地模拟临床上外伤性脑损伤的特点，复制局灶性和弥漫性损伤，包括局部皮质挫伤、硬膜下血肿、蛛网膜下腔出血和白质损伤等病变，但实践证明其死亡率高达40%，操作极为困难。2006年，我国学者林元相、徐如祥等[9]对铁离子注射模型进行部位及剂量的改良后发现，皮层注射氯化亚铁建立外伤性癫痫动物模型比既往杏仁体注射铁离子建立的模型更接近人类的外伤性癫痫临床与病理改变，且操作相对简单，成功率高，稳定可靠，为PTE研究提供了一个切实可行的全新造模方法。

随着医学的发展，高压氧治疗(Hyperbaric Oxygen Theray,HBOT)作为外伤性脑损伤的一种辅助疗法，其作用逐渐引起关注[10]。HBOT是指在高压氧仓内，吸入一个大气压(101.33 KPa)以上与环境等同压力的纯氧，通过人体血液循环携带更多的氧到病损的组织和器官，同时增加血氧弥散和组织内的氧含量迅速改善和纠正组织缺氧，防止和减轻缺氧性损害，促进病损组织的修复和功能恢复，从而达到治疗和抢救的目的[11,12]。

本研究采用皮层注射FeCl2建立外伤性癫痫大鼠模型与正常大鼠进行对照研究，从不同层面上探析HBOT对外伤性癫痫PTE的防治作用及机制。

1、材料与方法

1.1 实验动物及分组

18只健康雄性成年SD大鼠，体重160～180 g,SPF级，购自广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2008-0002。随机选取4只作为正常组，其余14只通过皮层注射氯化亚铁(0.1 mol/L,5μL)制作PTE模型，观察行为学表现以及脑电图改变，再采用随机数表法将存活者分为2组：模型对照组、高压氧治疗组。

1.2 主要试剂及仪器

表1 主要试剂及仪器

1.3 外伤性癫痫大鼠模型的制作

参照林元相、徐如祥等[9]皮层注射氯化亚铁建立外伤性癫痫的动物模型：大鼠以2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于立体定位仪上，剪去头顶部毛发，常规消毒皮肤，沿正中线切开头皮，逐层手术暴露颅骨，确定钻颅部位。以牙科钻钻开颅骨，用微量注射器缓慢进针至靶点(大鼠右额叶皮质坐标为：前囟前2.0 mm，中线旁3.0 mm，硬膜下2.0 mm)，并于该靶点放置大鼠皮层电极，连接到SynAmps2-Neuvo LTM EEG长程脑电监护系统(输入阻抗>10G ohms，共模抑制比>108DB，输入噪声4 uVpp 0.1-100HZ)。开始记录脑电图，10 min后用微量注射器向靶点缓慢注射5μL FeCl2(0.1 mol/L)，速率1μL/min，把握进针深度约3 mm；注射后留针5 min，骨蜡封闭钻孔后缝合切口。造模后全程监测脑电图，根据Racine分级，4级以上发作，脑电图在尖波或棘波的基础上出现阵发性或持续性异常放电为模型成功。

1.4 治疗方法

1.4.1 常规治疗

模型建立后进行常规治疗，包括：(1)鼻导管低流量吸氧2 h;(2)脱水，以呋塞米片1 mg溶于生理盐水2 m L灌胃，每天2次，连续7天；(3)防治感染，以青霉素2万u肌注，每天2次，连续7天。

1.4.2 高压氧治疗

进舱前将实验动物放入无菌spf级聚酯不透明透气笼(20×30 cm，独立间隔成小笼)，纯棉布罩覆盖。动物进舱后，采用匀速洗舱法(提高舱内吸入的氧浓度，把舱内的空气尽可能替换成氧气)：关闭舱门，打开供氧阀，当舱压达0.01 MPa时打开排氧阀，洗舱流量为200 L/min，洗舱时间约为10 min，调节排氧阀，控制升压速度在0.005～0.01 MPa/min，于15 min内将舱内压升至所需实验压力，然后关闭供、排氧阀门。控制减压速度为0.005～0.01 MPa/min，于15 min内将舱压降至“0”，然后打开舱门，取出实验动物。舱内氧浓度在80%～90%左右，可有效防止减压病及气压伤。治疗操作过程使用测氧仪随时监测舱内氧浓度，确保舱内氧浓度不低于80%，提高HBOT的有效性。严格执行HBOT方案，注意疗程间歇，每个疗程7天，每天1次，疗程之间间歇3天，防止实验动物发生减压病和氧中毒，共进行21次治疗，历时30天，接近临床对癫痫病人的阶段性治疗次数，以提高临床可比性和实用性。

1.5 标本留取

30 d后(其中2只造模后立即癫痫发作衰竭死亡，模型对照组中2只于造模后6 d衰竭死亡)，迅速以颈椎脱位法处死，冰上断头，取出大脑，分离右额叶、右海马，每只大鼠均取材两份，一半常规脱水、透明、石蜡包埋。切片参照林元相等[9]皮层注射氯化亚铁建立外伤性癫痫的动物模型：约位于右额叶(注射点层面)及海马层面连续冠状切片，厚3μm，每隔10片取2片，脱蜡至水。切片用于HE染色。另一半标本置入Trizol试剂用于RNA提取，进行实时荧光定量PCR检测。

1.6 实验引物设计

采用实时荧光定量PCR法，引物设计合成由南京金丝瑞生物技术有限公司完成，c-fos:F:5’-TCCAAGCGGAGACA GATCAAC-3’;R:5’-TCCAGGGAGGTCACAGACAT-3’;c-jun:F:5’-GCACATCACCACTACACCGA-3’;R:5’-GACAC TGGGCAGCGTATTCT-3’;c-mycF5’-CAGCTCGCCCAAATC CTGTA-3’;R:5’-TGATGGGGATGACCCTGACT-3’。以β-actin为参照基因，采用2-△△Ct法比较各样本中c-fos mRNA、c-jun mRNA、c-myc mRNA的表达水平。

1.7 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。m RNA数据为计量资料，用均数±标准差()表示。在符合正态分布的前提下，先进行方差齐性检验：如果方差齐，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间均数比较采用LSD检验；如果方差不齐，则采用非参数检验的Kruscal-Wallis法。P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果与讨论

2.1 FeCl2造模方法评价

铁离子在PTE癫痫病灶形成中发挥着稳定作用。理想的PTE动物模型，应该具备典型的行为表现学，外伤性脑损伤与癫痫的病理学特点，以及脑电生理上的改变，并且尽量接近临床上的发病机制。研究表明皮层注射FeCl2建立外伤性癫痫动物模型比既往杏仁体注射铁离子建立的模型更接近人类的外伤性癫痫临床与病理改变。因此，皮层注射FeCl2造模法更符合临床上外伤性癫痫的特点。

本研究中，采用Neuvo LTM EEG长程脑电监护系统监测皮层注射FeCl2建立外伤性癫痫大鼠模型，结果表明该皮层注射FeCl2造模法制备的PTE动物模型其临床与病理改变接近人类的外伤性癫痫，且该造模法操作相对简单，成功率高达85.7%，稳定可靠，为PTE研究提供了一个切实可行的全新造模方法，值得推广。

2.2 行为学观察及脑电图变化

皮层注射FeCl2造模成功后大鼠表现为：出现凝视、不动，呈阵发性，此后开始表现为湿狗样运动，重复、刻板地点头，可伴有面部抽动，以及轻度惊厥，严重者癫痫持续发作衰竭导致死亡。在30 d的行为学观察中，治疗组大鼠在高压氧治疗后7 d发作次数开始较模型组减少，主要为局灶性发作。正常组大鼠无上述表现。

皮层注射FeCl2后，置入皮层电极并连接于Neuvo LTM EEG长程脑电监护系统监测脑电图变化，结果如图1(a,b)所示，大鼠癫痫发作时可描记到多种形式的癫痫样放电波形，如单棘波(↓所示)、多棘波(↑所示)、双相棘波(△所示)等，可记录到发作后抑制波，与行为学表现高速同步。高压氧治疗组大鼠在治疗后发作次数减少，发作时仍可观察到典型癫痫样放电波形，如图1(c)所示，但频率较模型组低、波幅较模型组小。

图1 (a)正常组EEG;(b)模型对照组EEG;(c)高压氧治疗组EEG

2.2 实时荧光定量PCR检测早期快反应基因的表达水平

2.2.1 c-fos/c-jun/c-myc m RNA实时荧光定量的扩增曲线与融解曲线单峰图

一般情况下，早期快反应基因具有快速一过性高表达的特点。但在最近有关癫痫动物模型研究的零星文献中，发现c-fos具有长时程表达的特点，但早期快反应基因是否都存在长时程表达尚未得到实验研究完全证实。结合本实验结果，我们对早期快反应基因与PTE的关系作出如下探讨。在本实验中，我们应用实时荧光定量PCR法，在长时程(30d)后仍可检测到c-fos mRNA、c-jun mRNA、c-myc mRNA表达，表明在皮层注射氯化亚铁建立外伤性癫痫大鼠模型中，不仅c-fos,c-jun、c-myc也表现出长时程表达(图2)。这也间接印证了在不同刺激下，早期快反应基因表达的持续时间有所不同。

图2 c-fos/c-jun/c-myc mRNA实时荧光定量的扩增曲线与融解曲线单峰图

2.2.2 早期快反应基因的表达水平差异

所有数据采用SPSS 19.0统计学软件处理，结果如图2。在符合正态分布的前提下，先进行方差齐性检验：如果方差齐性，则采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间均数比较采用LSD检验；如果方差不齐，则采用非参数检验的Kruscal-Wallis法。设定P<0.05为差异有统计学意义。分析结果：

(1)模型组c-fos mRNA的表达水平较正常组上升，治疗组较模型组下降，且低于正常组(如图3a所示)。三组间c-fos表达水平差异无统计学意义(单因素方差分析，P>0.05)。

(2)模型组c-jun m RNA的表达水平较正常组下降(LSD检验，P>0.05)，治疗组较模型组下降(LSD检验，P<0.05)，且低于正常组(LSD检验，P>0.05)(如图3b所示)。

(3)模型组c-myc mRNA的表达水平较正常组上升(LSD检验，P<0.05)，治疗组较模型组下降(LSD检验，P<0.05)，且低于正常组(LSD检验，P<0.05)(如图3c所示)。

图3 (a)c-fos基因表达水平差异；(b)c-jun基因表达水平差异；(c)基因表达水平差异

3、结论

本研究通过皮层注射FeCl2(0.1 mol/L,5μL)建立外伤性癫痫大鼠模型。造模成功后大鼠出现典型的行为学表现，严重者癫痫持续发作衰竭导致死亡。皮层注射FeCl2后，置入皮层电极并连接于Neuvo LTM EEG长程脑电监护系统监测脑电图变化，结果显示大鼠癫痫发作时可描记到多种形式的癫痫样放电波形，同时可记录到发作后抑制波，与行为学表现高速同步。该结果表明联合Neuvo LTM EEG长程脑电监护系统监测皮层注射FeCl2建立外伤性癫痫大鼠模型，在行为学上、脑电图变化以及病理改变均接近人类的外伤性癫痫临床与病理改变，且操作相对简单，成功率高(85.7%)，稳定可靠，为PTE研究提供了一个切实可行的全新造模方法。实验结果显示在皮层注射FeCl2建立外伤性癫痫大鼠模型中，c-fos、c-jun、c-myc mRNA均呈现出长时程表达的特点。皮层注射FeCl2后可能无法通过引起活化蛋白转录因子-1(AP-1)过度表达导致癫痫发作，或者在长时程阶段c-fos与c-jun虽仍可检测出，但可能已衰减至组间无统计学差异。皮层注射FeCl2后可能通过诱导神经细胞凋亡导致癫痫发作，而c-myc可能在此过程中占主导作用。其可能机制是皮层注射FeCl2后，引起c-myc的过度表达，下调细胞凋亡抑制基因Bcl-2与上调细胞凋亡促进基因Bax的表达水平，诱导神经细胞凋亡，从而导致癫痫发作。HBO可能通过改善TBI所导致的缺血缺氧，作用于c-junN末端激酶-1(JNK-1)信号通路，干预JNK的磷酸化以及AP-1的过度活化，从而阻断c-jun的表达以及神经细胞凋亡，起到治疗PTE的作用。HBO可以下调c-myc的表达水平，并可能通过上调细胞凋亡抑制基因Bcl-2并下调细胞凋亡促进基因Bax的表达水平，抑制神经细胞凋亡，达到治疗PTE的效果。从基因层面分析，皮层注射FeCl2建立PTE动物模型模拟了PTE部分发病机制，HBOT可明确阻断发病相关通路。

参考文献:

[9]林元相,徐如祥,姜晓丹,等.皮层注射氯化亚铁建立外伤性癫痫动物模型[J].中华神经医学杂志,2006,5(4):372-377.

文章来源:周文,陈史芳,杨宇等.氯化亚铁溶液建立大鼠外伤性癫痫的造模方法及高压氧治疗研究[J].广东化工,2023,50(24):60-62+72.