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高级别神经胶质瘤放化疗前后T淋巴细胞亚群的变化及预后

2024-02-21 107 上传者：管理员

摘要：目的:观察高级别胶质瘤患者接受同步放化疗前后，T细胞亚群百分比的变化，并分析其与预后的关系。方法:收集2016年01月至2022年12月首都医科大学附属北京世纪坛医院肿瘤内科收治的62例高级别神经胶质瘤患者，同时收集30名健康体检者的血液样本做为对照，抽取患者同步放化疗开始前1天和放化疗结束后第1天空腹外周血5 mL,采用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群(CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD8+/CD28-、CD8+/CD28+)水平。结果:治疗前胶质瘤患者的CD3+/CD4+细胞水平低于健康对照组(P=0.027)，同步放化疗前后，CD3+/CD4+细胞、CD8+/CD28-细胞百分比出现显著下降，而CD3+/CD8+细胞百分比出现上升，CD3+/CD4+、CD8+/CD28-和CD3+/CD8+细胞前后变化差异具有统计学意义(P <0.05)。62例患者中位总生存期为31.9个月，放化疗前CD8+/CD28-细胞百分比升高的患者较未升高的患者生存期缩短，分别为29.3和36.3个月(P=0.045)。结论:放化疗改变了胶质瘤患者的免疫环境，CD8+/CD28-T细胞百分比升高可以作为高级别胶质瘤患者生存不佳的预后指标。

关键词：
HGG
同步放化疗
淋巴细胞亚群
神经胶质瘤
预后
高级别胶质瘤
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恶性神经胶质瘤是中枢神经系统恶性程度最高的肿瘤，患者常伴有肢体功能障碍，严重影响生活质量，高级别胶质瘤(high grade glioma, HGG)特别是胶质母细胞瘤患者的中位生存期仅14.6个月，临床上缺乏特异性的肿瘤标志物去预测胶质瘤患者的治疗疗效和预后。近些年的研究发现，T淋巴细胞可穿过血脑屏障，与相应的抗原结合，激活免疫系统，肿瘤部位的淋巴细胞浸润是影响胶质瘤的预后因素之一[1]。考虑到临床实践中患者只有在手术或活检时才能够获得肿瘤组织，并且不能实时反映疾病的进展，临床上常用外周血T淋巴细胞亚群作为检测患者免疫状态的手段。本研究采用流式细胞术分析62例高级别恶性神经胶质瘤患者，同步放化疗前后外周血中T淋巴细胞亚群的变化，并探讨了T淋巴细胞亚群与患者总生存时间(overall survival, OS)的关系。

1、资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年01月至2022年12月我院肿瘤内科收治的62例高级别神经胶质瘤患者，经手术或活检病理明确为WHO 3级和WHO 4级(2016 WHO分级),年龄23～82岁，中位年龄49岁，男性38例，女性24例，均为幕上神经胶质瘤，手术后1～3个月内接受同步放化疗治疗，除外预计生存期不超过3个月、合并其他严重疾病的患者。同时收集在我院健康体检中心进行体检的30名健康人的血液样本作为对照，男性12例，女性18例，年龄22～72岁，中位年龄43岁，对照组肝肾功能正常，无自身免疫病患者，健康对照组和患者组在性别、年龄方面，差异没有统计学意义(P>0.05,P=0.074)。患者均签署了研究知情同意书。本研究通过了我院伦理委员会的伦理批准。

1.2 同步放化疗方案

62例患者术后1～3个月内均接受了调强适形放疗(intensity modulated radiotherapy, IMRT)同步替莫唑胺化疗。根据患者手术切除程度、术后残留情况确定放疗靶区和放疗剂量，最终放疗剂量为(58.0～60.0) Gy/(30～32) f, (1.8～2.0) Gy/f, 治疗时间约6周。放疗期间同时口服替莫唑胺胶囊(TMZ),75 mg/(m2·d),共42天。

1.3 外周血T淋巴细胞亚群检测

于同步放化疗开始前1天和放化疗结束后第1天，分别抽取患者空腹外周血5 mL,采用流式细胞仪(美国BD公司)检测外周血淋巴细胞亚群(CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD8+/CD28-、CD8+/CD28+)水平。

1.4 生存期评价

自患者确诊病理开始，至患者死亡或随访截止计算患者总生存时间，随访日期截止至2022年12月31日，共有51例患者死亡，11例患者存活。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，计量资料符合正态分布，方差齐，以均数±标准差表示，两组间数据比较采用t检验，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存分析采用Cox回归，P≤0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 患者放化疗前和健康对照者T淋巴细胞亚群的比较

高级别胶质瘤患者同步放化疗前CD3+/CD4+的细胞百分比水平低于健康对照组，分别为(38.3±8.2)%和(40.96±2.99)%(P=0.027),而CD3+/CD8+和CD3+细胞的水平两组之间的差别无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 患者治疗前和健康者的T淋巴细胞亚群百分比水平的比较

2.2 同步放化疗前后患者T淋巴细胞亚群的比较

同步放化疗前，62例患者外周血CD3+/CD4+细胞百分比为(38.3±8.2)%,CD3+/CD8+细胞百分比为(28.11±9.17)%,CD8+/CD28-细胞百分比为(26.32±9.68)%,CD8+/CD28+百分比为(14.53±5.84)%,同步放化疗后62例患者外周血CD3+/CD4+细胞百分比为(30.0±8.4)%,CD3+/CD8+细胞百分比为(36.65±11.43)%,CD8+/CD28-细胞百分比为(20.12±8.48)%,CD8+/CD28+细胞百分比为(16.08±6.89)%。同步放化疗前后，CD3+/CD4+细胞、CD8+/CD28-细胞百分比出现显著下降，而CD3+/CD8+细胞百分比出现上升，这三种T淋巴细胞亚群前后变化差异具有统计学意义(P<0.05),而CD8+/CD28+细胞百分比水平在同步放化疗前后差异无统计学意义(P=0.160),见表2。

2.3 生存期分析

62例患者生存期为6.5～84.0个月，中位总生存期为31.9个月，1、2、3年总生存率分别为92%、77%、37%。WHO 3级患者共33例，中位生存期为38.4个月(14.1～70.1个月),WHO 4级患者共29例，中位生存期为27.8个月(6.5～84.0个月),两组间生存期差异有统计学意义(P=0.043)。

2.4 T淋巴细胞亚群与生存期的关系

62例患者中，放化疗前CD8+/CD28-细胞百分比升高的患者较未升高的患者生存期缩短，分别为29.3和36.3个月(P=0.045,图1),其余T淋巴细胞亚群各亚组之间的总生存期结果显示无统计学差异(表3)。将患者年龄、性别、病理级别、手术切除(全切/次全切)或活检、淋巴细胞亚群表达水平是否降低(CD3+/CD4+、CD3+/CD8+)、淋巴细胞亚群表达水平是否升高(CD8+/CD28-、CD8+/CD28+)纳入多因素分析，结果显示病理级别、手术切除、CD8+/CD28-淋巴细胞亚群表达水平是影响患者总生存期的独立预后因素(表4)。

表2 同步放化疗前后62例患者T淋巴细胞亚群百分比水平的比较

图1 CD8+/CD28-T淋巴细胞升高组和非升高组胶质瘤患者的生存曲线

表3 62例患者不同T淋巴细胞亚群同总生存期的关系

3、讨论

HGG特别是胶质母细胞瘤(GBM)做为一种“冷肿瘤”,是免疫抑制性最强的肿瘤之一，包括内源性和外源性两个方面。前者包括肿瘤抗原的下调[2],如肿瘤抗原缺乏、抗原提呈细胞(antigen-presenting cells, APC)不能有效地将肿瘤抗原提呈给T细胞、T细胞活化失败、T细胞迁移受损等多种因素导致低活化T细胞浸润。外源性机制也会导致胶质瘤的免疫抑制，例如浸润淋巴细胞上免疫检查点的高表达[3]和胶质母细胞瘤衍生的细胞抑制因子以及大量免疫抑制细胞浸润到肿瘤微环境中[4]。活化的T细胞在启动和促进抗肿瘤免疫中至关重要，有学者发现GBM微环境中T细胞浸润增加与GBM患者生存期延长相关[5]。而引起全身性的T细胞功能严重缺陷是HGGs最突出的免疫特点之一[6]。我们的研究发现，相比健康对照组，胶质瘤患者在接受治疗前以及在同步放化疗治疗后出现了CD4+淋巴细胞计数下降，提示相关淋巴细胞减少，这与CARMEN等学者的结果一致[7],后者在96例接受放疗和替莫唑胺治疗的高级别胶质瘤患者中，发现CD4计数在长达1年的随访中持续较低，并且计数较低的患者更容易因肿瘤进展而较早死亡。严重的免疫抑制与胶质瘤患者的不良结局有关，并且导致了胶质瘤患者对免疫治疗的疗效不佳。

表4 影响高级别胶质瘤患者总生存时间的多因素分析

GBM患者经常表现出具有临床意义的淋巴细胞减少症，有学者发现在300名GBM受试者中存在淋巴细胞减少症的比例达24.7%,对照组仅为10.9%,进一步的研究发现T细胞表面S1P1受体(鞘氨醇-1-磷酸受体1)丢失而导致骨髓中大量的幼稚T细胞被封存[8]。多因素免疫缺陷的后果就是严重的抗肿瘤免疫抑制状态，并且难以建立起针对肿瘤的有效的免疫应答。KELLY等学者发现，不同剂量的替莫唑胺(TMZ)可以改变肿瘤周围免疫细胞的组成，TMZ可以诱导淋巴细胞耗竭，在消融肿瘤细胞和免疫抑制性单核细胞的同时不影响抗原提呈细胞的能力，这样可以产生更强的免疫应答，暨总体淋巴细胞减少，但稳态的恢复导致抗原特异性T细胞增殖增加，抑制性免疫细胞减少[9],加之淋巴细胞对辐射也非常敏感，我们的结果显示同步放化疗后CD4+T细胞计数降低，CD8+T细胞计数增高，表明放化疗改变了胶质瘤细胞周围的免疫环境，免疫抑制作用降低。

CD8+细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell, CTL)能够识别常见的肿瘤抗原，并在肿瘤特异性免疫应答中发挥重要作用，而CD28是T细胞活化所必需的不可缺少的共刺激分子，其作用对于CD8+CTL的正常激活至关重要[10]。CD28是一种44 kDa的同源二聚体膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，在95%的CD4+T细胞和将近50%的CD8+T细胞上表达[11]。CD28与表达在抗原提呈细胞上的配体顺式-B7(CD80和CD86)相互作用触发CD28信号传导，并促进CD8+ T细胞存活、迁移和细胞因子产生。在小鼠肿瘤模型中，顺式-B7:CD28分子相互作用的减少降低了肿瘤内T细胞的数量并加速了肿瘤生长[12]。目前的证据表明，CD28的下调是衰老CD8+T细胞的标志，这一现象由多种生物过程触发，包括端粒损伤、调节性T细胞(Treg细胞)诱导和肿瘤相关应激，此时T细胞不再能够进入有丝分裂，但仍能存活，并显示出免疫抑制功能[10]。CD8+/CD28-T细胞通过诱导抑制性受体(如免疫球蛋白样转录本3,ILT3和ILT4)直接抑制DC细胞的抗原提呈功能，导致DC细胞的免疫耐受性提高，继而失活CD4+/CD25+T细胞并将其转化为Treg细胞，Treg细胞又通过诱导T细胞免疫衰老来继续免疫抑制级联反应[13]。因此，CD8+/CD28-衰老T细胞是由Treg细胞介导的免疫抑制的重要介质和放大器。

DANIELA等在鼻咽癌患者中发现CD8+/CD28-T细胞水平的升高与患者的不良预后相关[14]。OLESJA报道了42例感染了巨细胞病毒的胶质母细胞瘤患者，CD57+CD28-T细胞水平较高的患者的总生存期明显缩短(17.5个月 vs 24个月)[15]。在我们的研究中发现，治疗前患者的CD8+/CD28-T细胞百分比的均数±标准差为(26.32±9.68)%,高于正常水平，提示CD8+/CD28-T细胞在高级别胶质瘤中也在塑造免疫抑制环境，并且我们也进一步发现，62例患者放化疗前CD8+/CD28-T淋巴细胞升高的患者较未升高的患者生存期缩短，分别为29.3个月和36.3个月(P=0.045)。CD28分子的丢失意味着CD8+T细胞的衰老，这有利于形成中枢神经系统的免疫耐受环境，导致神经胶质瘤细胞可以相对不受免疫系统的限制而生长[16],提示CD8+/CD28-T淋巴细胞数目降低可以作为HGG患者生存不佳的预后指标。但本研究受限于样本量较小，可能存在检验效能不足的问题，后续需要进一步扩大样本量进行大规模队列研究证实。

在过去的几年中，许多研究已经尝试使用免疫疗法来增强神经胶质瘤患者的免疫应答，消除或减少免疫抑制细胞的浸润，增加效应T细胞的数量和活性，是免疫治疗成功的关键。先前的CD28激动剂如TGN412由于毒性而没有成功地应用于临床，针对CD28和CTLA-4信号传导下游的主要调节因子Cbl-b(Casitas B lymphoma-b)的新型抑制剂已显示出逆转肿瘤微环境中的免疫抑制、刺激细胞毒性T细胞活性和促进肿瘤消退的特性[17]。我们的研究提示CD8+/CD28-T细胞水平升高与患者预后不良有关，放化疗前高水平的 CD8+/CD28-T 淋巴细胞可做为高级别胶质瘤患者生存不佳的预测指标，有助于临床实现患者的分层管理与精准治疗。此外，本研究结果进一步证实了高级别胶质瘤免疫微环境的免疫抑制学说，为后续进行针对CD8+/CD28-T淋巴细胞的基础研究和药物研发奠定了基础。

基金资助:北京市自然科学基金教育委员会科技计划重点项目(编号:KZ2021100225029);

文章来源:李珊,赵艳杰,赵玉泽等.高级别神经胶质瘤放化疗前后T淋巴细胞亚群的变化及与预后的关系[J].现代肿瘤医学,2024,32(05):829-833.