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不同剂量艾司氯胺酮预处理对脑缺血性损伤小鼠的神经保护作用

2024-04-10 7 上传者：管理员

摘要：目的探讨不同剂量艾司氯胺酮预处理对脑缺血性损伤小鼠的神经保护作用及可能机制。方法成年雄性C57BL/6小鼠44只随机分为假手术组、模型组、低剂量组和高剂量组各11只。模型组、低剂量组、高剂量组采用永久性结扎阻断右大脑中动脉和暂时性阻断双侧颈总动脉建立局灶性脑缺血模型，假手术组仅暴露动脉；低剂量组和高剂量组在夹闭双侧颈总动脉前分别腹腔注射艾司氯胺酮6、12 mg/kg,假手术组和模型组腹腔注射等体积生理盐水。造模24 h时采用Longa评分和贴纸实验观察小鼠神经行为学改变，采用实时荧光定量PCR法检测缺血脑组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg-1)、Beclin 1 mRNA相对表达量；造模72 h时采用TTC染色法观察脑梗死面积。结果 (1)模型组Longa评分[(2.36±0.51)分]均高于假手术组(0分)、低剂量组[(1.27±0.47)分]、高剂量组[(1.91±0.54)分](P<0.05),低剂量组、高剂量组均高于假手术组(P<0.05),高剂量组高于低剂量组(P<0.05);模型组碰触贴纸时间[(23.18±2.36)s]、移除贴纸时间[(26.36±1.96)s]均长于假手术组[(5.27±1.42)、(6.73±1.95)s]、低剂量组[(6.73±1.42)、(8.82±1.89)s]、高剂量组[(15.65±3.08)、(18.91±3.11)s](P<0.05),高剂量组均长于假手术组、低剂量组(P<0.05),假手术组与低剂量组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)高剂量组脑梗死面积[(23.45±0.84)%]均大于假手术组(0)、模型组[(19.03±0.99)%]、低剂量组[(15.98±0.97)%](P<0.05),模型组、低剂量组均大于假手术组(P<0.05),模型组大于低剂量组(P<0.05)。(3)假手术组缺血脑组织Arg-1、iNOS mRNA相对表达量(0.99±0.15、1.00±0.29)均低于模型组(12.37±2.99、4.17±0.76)、低剂量组(17.16±3.78、2.02±0.21)、高剂量组(5.64±0.51、1.94±0.21)(P<0.05);模型组、高剂量组缺血脑组织Arg-1 mRNA相对表达量均低于低剂量组(P<0.05),高剂量组低于模型组(P<0.05);低剂量组、高剂量组缺血脑组织iNOS mRNA相对表达量均低于模型组(P<0.05),低剂量组与高剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。低剂量组缺血脑组织Beclin 1 mRNA相对表达量(0.35±0.03)均低于假手术组(0.73±0.18)、模型组(0.91±0.08)、高剂量组(0.87±0.06)(P<0.05);模型组高于假手术组(P<0.05),与高剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05);高剂量组与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论低剂量艾司氯胺酮可促进局灶性脑缺血小鼠缺血区小胶质细胞从M1向M2型转化、抑制神经炎性反应和降低自噬进而发挥神经保护作用，高剂量艾司氯胺酮对脑缺血性损伤无明显神经保护作用。

关键词：
小胶质细胞
神经炎症
缺血性脑损伤
自噬
艾司氯胺酮
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脑卒中已成为全球人口第2大死亡原因和首要致残原因[1]。缺血性脑卒中后神经功能损伤与神经炎症密切相关，缺血脑组织发生炎性反应，进而加重血脑屏障破坏、微血管衰竭、脑水肿等导致继发性脑损伤[2]。艾司氯胺酮是氯胺酮的右旋异构体，属非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂，有良好的镇静、镇痛、抗炎和抗抑郁等作用[3]。艾司氯胺酮通过减轻谷氨酸神经毒性、抗氧化应激、抗炎、抗惊厥和抑制扩散性去极化而对重症脑损伤发挥神经保护作用[4]。但目前关于艾司氯胺酮神经保护作用的用药剂量和给药方法尚无定论。本研究探讨不同剂量艾司氯胺酮预处理对脑缺血性损伤小鼠的神经保护作用及可能机制，报道如下。

1、材料与方法

1.1 一般材料

SPF级成年雄性C57BL/6小鼠44只，6～8周龄，体质量18～22 g, 购自北京华阜康生物科技有限公司[实验动物许可证号：SCXK(京)2019-0008]。小鼠饲养条件：室温23 ℃,湿度50%左右，12 h明暗交替，自由进食、饮水，适应性饲养3 d后进行实验。本研究经首都医科大学附属北京友谊医院实验动物伦理委员会批准通过(伦理批准号：21-2025)。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与仪器

盐酸艾司氯胺酮(江苏恒瑞医药股份有限公司),水合氯醛粉剂[默克生命科学(上海)有限公司],2,3,5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)、Trizol(美国Sigma公司),反转录试剂盒(日本Takara公司),SYBR Green 荧光定量试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司),3M动物组织黏胶(美国3M公司),实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.2.2 脑缺血模型建立

44只小鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量组和高剂量组各11只。模型组、低剂量组、高剂量组采用永久性结扎阻断右大脑中动脉和暂时性阻断双侧颈总动脉建立局灶性脑缺血模型，假手术组仅分离右大脑中动脉和双侧颈总动脉；低剂量组和高剂量组在夹闭双侧颈总动脉前分别腹腔注射艾司氯胺酮6、12 mg/kg, 假手术组和模型组腹腔注射等体积生理盐水。局灶性脑缺血模型建立：采用经典大脑中动脉远端结扎法[5]建立局灶性脑缺血小鼠模型，即经腹腔注射体积分数4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)麻醉小鼠，待翻正反射消失后，将小鼠左侧卧位固定并消毒，在耳屏与右眼外眦连线做垂直切口，电钻研磨颞骨开颅，于颞骨偏向颅底部暴露呈Y型的大脑中动脉主干及分支，用10-0缝合线结扎大脑中动脉主干，黏合颞部伤口。随后将小鼠仰卧固定消毒，通过颈部正中切口钝性分离出左、右颈总动脉，无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉7 min, 松开动脉夹，缝合伤口。小鼠苏醒前在37 ℃恒温电热毯上进行保温，术后常规饲养。

1.2.3 神经行为学测试

造模24 h时4组小鼠行神经行为学测试，评估神经功能障碍严重程度及感觉和运动功能恢复情况。(1)采用Longa评分评估神经功能障碍严重程度，Longa评分1～3分为造模成功，0分、4分和死亡小鼠剔除实验。Longa评分标准[6]:0分，无症状；1分，提尾时损伤侧前肢不能伸直；2分，行走时向损伤侧旋转；3分，行走时向损伤侧倾倒；4分，不能自发性行走、意识丧失。(2)贴纸实验[7]:造模前将3M医用胶带剪成约3 mm×3 mm正方形贴纸备用，造模前连续3 d进行两侧前肢贴纸训练，3次/d, 使所有小鼠在术前均可迅速撕下贴纸。造模24 h时行正式贴纸测试实验，首先将小鼠放置在擦拭干净的测试笼内适应1 min以上，将正方形贴纸贴在小鼠一侧前肢掌侧，然后以同等力度触碰另一侧前肢掌侧，将小鼠放入测试笼内开始计时，观察并记录小鼠碰触贴纸时间和移除贴纸时间。间隔至少10 min后以同样方法测试另一侧肢体。

1.2.4 缺血脑组织精氨酸酶-1(arginase-1, Arg-1)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、Beclin1 mRNA相对表达量检测

采用实时荧光定量PCR法。神经行为学测试结束后每组随机选取6只小鼠，腹腔注射体积分数4%水合氯醛深麻醉后开胸，经左心室灌注生理盐水至灌洗液清亮后，取出脑并分离缺血区脑组织，采用Trizol试剂提取总RNA,应用反转录试剂盒反转录为cDNA后进行PCR扩增。PCR反应体系：cDNA 5 μL,上、下游引物各0.4 μL,SYBR Green Master Mix 10 μL,DEPC处理水4.2 μL,共20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 2 min; 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 1 min, 共40个循环。以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算缺血脑组织Arg-1、iNOS、Beclin 1 mRNA相对表达量。引物由北京天一辉远科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.2.5 脑梗死面积测定

采用TTC染色法测定脑梗死面积作为评价脑损伤程度的金标准[8]。造模72 h时每组剩余的5只小鼠腹腔注射体积分数4%水合氯醛深麻醉后处死动物，取出脑组织，置于-20 ℃冰箱约15 min; 取出脑组织后去除嗅球和小脑，沿冠状面切片，厚度约1 mm, 将脑组织切片立即放入已预热的含质量分数1% TTC溶液的玻璃皿中，37 ℃水浴避光染色15 min, 每5 min翻面1次，待染色完全后清水冲洗，将脑组织切片排序并拍照。观察染色后脑组织颜色变化，白色区域为梗死区，红色区域为非梗死区。采用Swanson法[9]计算脑梗死面积，脑梗死面积(%)=(S1-Sr)/(2S1)×100%(S1:脑组织切片健侧总面积，Sr: 脑组织切片患侧非梗死区面积)。

1.3 统计学处理

应用GraphPad Prism 9软件进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差表示，2组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 4组脑缺血后神经行为学改变比较

模型组Longa评分均高于假手术组、低剂量组、高剂量组(P<0.05),低剂量组、高剂量组均高于假手术组(P<0.05),高剂量组高于低剂量组(P<0.05)。模型组碰触贴纸时间、移除贴纸时间均长于假手术组、低剂量组、高剂量组(P<0.05),高剂量组均长于假手术组、低剂量组(P<0.05),假手术组与低剂量组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 4组脑缺血后神经行为学改变比较

2.2 4组脑梗死面积比较

假手术组、模型组、低剂量组、高剂量组脑梗死面积[0、(19.03±0.99)%、(15.98±0.97)%、(23.45±0.84)%]比较差异有统计学意义(F=80.622,P<0.001);高剂量组脑梗死面积均大于假手术组、模型组、低剂量组(P<0.05),模型组、低剂量组均大于假手术组(P<0.05),模型组大于低剂量组(P<0.05)。见图1。

图1 4组脑冠状切片TTC染色图

2.3 4组缺血脑组织Arg-1、iNOS、Beclin 1 mRNA相对表达量比较

假手术组缺血脑组织Arg-1、iNOS mRNA相对表达量均低于模型组、低剂量组、高剂量组(P<0.05);模型组、高剂量组缺血脑组织Arg-1 mRNA相对表达量均低于低剂量组(P<0.05),高剂量组低于模型组(P<0.05);低剂量组、高剂量组缺血脑组织iNOS mRNA相对表达量均低于模型组(P<0.05),低剂量组与高剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。低剂量组缺血脑组织Beclin1 mRNA相对表达量均低于假手术组、模型组、高剂量组(P<0.05);模型组高于假手术组(P<0.05),与高剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05);高剂量组与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 4组缺血脑组织Arg-1、iNOS、Beclin 1 mRNA相对表达量比较

3、讨论

麻醉药物预处理可作为心脏、脑、肾脏等缺血再灌注损伤的脏器保护方法，主要机制包括抑制氧化应激、调节线粒体功能、抑制炎性反应和细胞凋亡等[7,10]。脑缺血性损伤与神经炎症和自噬密切相关[11]。脑缺血后小胶质细胞快速激活，释放促炎介质，导致炎症细胞向中枢神经系统快速聚集，触发细胞凋亡、自噬等死亡程序，这些因素相互作用引发级联反应，加重脑损伤[2]。艾司氯胺酮可通过减轻谷氨酸神经毒性、抗氧化应激、抗炎、抗惊厥和抑制扩散性去极化等方式发挥神经保护作用[6]。但既往研究中艾司氯胺酮对脑损伤神经保护的用药剂量和方法并不一致。Reeker等[12]在不完全性脑缺血大鼠模型中静脉泵注艾司氯胺酮1 mg/(kg·min)30 min可明显改善神经功能。而王秀红等[13]研究发现，单次腹腔注射艾司氯胺酮10 mg/kg即可明显改善老龄小鼠剖腹探查手术后的认知功能。由于动物腹腔注射与人体静脉注射药代动力学存在差异，本研究选择临床推荐的艾司氯胺酮静脉麻醉诱导剂量0.5～1 mg/kg, 根据文献[14]换算等效剂量为小鼠腹腔注射艾司氯胺酮6～12 mg/kg。本研究分析高、低剂量艾司氯胺酮预处理对缺血性脑损伤小鼠的神经保护作用，可为临床艾司氯胺酮的剂量选择提供参考。

Longa评分常用于评估动物脑缺血损伤的严重程度，脑缺血后表现为对侧前肢运动障碍，评分越高，神经功能损伤程度越重[15]。贴纸实验是评估小鼠感觉运动功能的常用方法，脑缺血性损伤可引起损伤对侧前肢感觉和运动障碍，表现为小鼠感觉到带有贴纸的时间(即碰触时间)及撕下贴纸的时间延长，可评估感觉运动功能受损的程度[5,7]。脑梗死面积是反映脑损伤严重程度的金标准[8]。Wang等[16]发现，创伤性脑损伤小鼠应用亚麻醉剂量的氯胺酮(10 mg/kg)即可发挥神经保护作用。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组Longa评分增高，碰触贴纸时间和移除贴纸时间延长，脑梗死面积增大，提示局灶性脑缺血小鼠模型建立成功。本研究结果显示，与模型组比较，低剂量组Longa评分降低，碰触贴纸时间和移除贴纸时间均缩短，脑梗死面积减小，提示低剂量艾司氯胺酮对脑缺血性损伤小鼠有明显神经保护作用。而与模型组比较，高剂量组Longa评分降低，碰触贴纸时间和移除贴纸时间均缩短，但脑梗死面积增大；与低剂量组比较，高剂量组Longa评分增高，碰触贴纸时间和移除贴纸时间均延长，脑梗死面积增大，表明高剂量艾司氯胺酮(12 mg/kg)虽在一定程度上改善脑缺血性损伤时感觉和运动功能，但未缩小脑梗死面积，提示其对脑缺血损伤的神经保护作用有限。王秀红等[13]研究发现，腹腔注射亚麻醉剂量的艾司氯胺酮(10 mg/kg)可抑制小胶质细胞激活，减少神经炎症，从而改善老龄小鼠剖腹探查手术后认知功能，提示低剂量艾司氯胺酮即可发挥神经保护作用。

小胶质细胞M1/M2型极化转变在神经炎症发生中发挥重要作用，iNOS是M1型小胶质细胞表面标志物，Arg-1是M2型小胶质细胞表面标志物[17]。自噬相关蛋白Beclin 1是介导自噬体形成的重要因子，可作为自噬标志物[11]。本研究结果显示，与模型组比较，低剂量组缺血脑组织iNOS、Beclin 1 mRNA相对表达量降低，Arg-1 mRNA相对表达量增高，提示低剂量艾司氯胺酮可抑制M1型小胶质细胞活化，促进M2型小胶质细胞活化，减轻缺血脑组织炎性反应，减少自噬体形成。低剂量氯胺酮(10 mg/kg)发挥神经保护作用与抑制神经炎症和自噬有关[16]。本研究结果显示，高剂量组缺血脑组织Arg-1、iNOS mRNA相对表达量均低于模型组，Beclin 1 mRNA相对表达量与模型组比较差异无统计学意义，表明高剂量艾司氯胺酮可抑制M1型小胶质细胞活化，减少促炎因子释放，可能与一定程度神经功能改善有关；但高剂量艾司氯胺酮同时抑制小胶质细胞向M2型分化，抑制抗炎因子产生，而过度自噬最终导致脑梗死面积增大，使其神经保护作用消失。与低剂量组比较，高剂量组缺血脑组织Arg-1 mRNA相对表达量降低，Beclin 1 mRNA相对表达量增高，表明艾司氯胺酮仅在低剂量时有明显神经保护作用，可能是由于低剂量艾司氯胺酮通过促进小胶质细胞由M1型向M2型转化，抑制神经炎性反应和减少自噬形成从而发挥神经保护作用。但艾司氯胺酮如何通过iNOS、Arg-1影响Beclin 1表达进而对脑缺血性损伤发挥神经保护作用尚需进一步研究。

本研究结果提示，低剂量艾司氯胺酮可促进局灶性脑缺血小鼠缺血区小胶质细胞从M1向M2型转化、抑制神经炎性反应和降低自噬进而发挥神经保护作用，高剂量艾司氯胺酮对脑缺血性损伤无明显神经保护作用。但本研究仅于造模24 h时测定神经炎症和自噬相关生物标志物表达情况，未观察这些指标的动态变化，尤其是小胶质细胞亚型转换和自噬动态变化与艾司氯胺酮神经保护作用的关系；本研究选取6～8周龄健康雄性小鼠，但性别、年龄均可影响缺血性脑损伤的严重程度和转归[18],本研究结果可能不适用于雌性和老年小鼠，尚需进一步研究证实。

参考文献:

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[9]唐红,吕倩忆,汪红娟,等.针刺激活Ⅲ型PI3K/Beclin-1通路调控脑缺血再灌注损伤大鼠缺血侧海马区细胞自噬[J].针刺研究,2023,48(5):423-430.

[13]王秀红.亚麻醉剂量艾司氯胺酮调控小胶质细胞TLR4/NF-κB通路对术后认知影响及机制研究[D].南昌:南昌大学,2021.

[14]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学(第三版)[M].北京:人民卫生出版社,2003:202-203.

基金资助:北京市自然科学基金(7192047);

文章来源:高颖,李璐,金沐,等.不同剂量艾司氯胺酮预处理对脑缺血性损伤小鼠的神经保护作用[J].中华实用诊断与治疗杂志,2024,38(04):354-358.