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探索谷氨酸转运体抑制剂DHK如何作用于小鼠焦虑样行为

2020-05-29 470 上传者：管理员

摘要：目的探讨谷氨酸转运体抑制剂二氢红藻氨酸对旷场测试中小鼠焦虑样行为的影响。方法将18只ICR小鼠随机分为溶媒组和DHK组每组9只。2组小鼠分别进行连续2d的旷场测试,每天各10min。在第1次旷场测试(OFT1)前30min小鼠侧脑室注射DHK或溶媒,OFT1后24h进行第2次旷场测试(OFT2),观察2次旷场测试中小鼠直立样行为时间、理毛时间、进入中央区时间和穿越格子数。结果在OFT1和OFT2中,与溶媒组相比,DHK组小鼠直立样行为时间、理毛时间、进入中央区时间和穿越格子数均无统计学意义(均P>0.05)。结论DHK注射30min或24h不影响旷场测试中小鼠焦虑样行为及活动水平。

关键词：
侧脑室给药
小鼠
旷场测试
焦虑样行为
生理学
病理过程
谷氨酸转运体抑制剂
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谷氨酸是中枢神经系统中的主要兴奋性氨基酸,并且参与各种关键性生理和病理过程。谷氨酸稳态的破坏可导致许多神经系统疾病[1,2,3,4]。兴奋性氨基酸转运蛋白在谷氨酸的突触再摄取中起关键作用。EAAT家族包括5种亚型,即人类中的EAAT1-5以及啮齿动物中相应的胶质谷氨酸/天冬氨酸转运体、谷氨酸转运蛋白-1、兴奋性氨基酸载体1(、兴奋性氨基酸转运体4和兴奋性氨基酸转运体5[5]。GLAST(EAAT1)和GLT-1(EAAT2)主要在星形胶质细胞中表达,而EAAC1(EAAT3),EAAT4和EAAT5是神经元特异性转运蛋白[6]。其中,GLT-1是主要的谷氨酸转运蛋白,占脑组织中谷氨酸摄取总量的90%以上[5,7]。

诸多证据表明,阻断谷氨酸摄取会导致异常行为。例如,侧脑室内注射或前额叶皮层显微注射GLT-1抑制剂二氢红藻氨酸皮层会诱导快感缺失[8,9],鞘内或侧脑室内注射非选择性谷氨酸转运蛋白抑制剂L-trans-PDC诱导对排尿反射起抑制作用[10],GLT1复合物表达水平与记忆训练相关[11]。谷氨酸摄取的阻断影响突触传递和可塑性[12,13,14],侧脑室注射DHK损害小鼠新颖物体识别学习能力[15]。然而,GLT1阻断对焦虑样行为的影响仍然很少受到关注。旷场测试是一种检测焦虑样行为的方法,如今已得到广泛应用。本研究基于旷场测试评价侧脑室注射DHK对小鼠焦虑样行为的影响。

1、材料与方法

1.1实验动物及分组

18只雄性ICR小鼠(30～35g)购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。小鼠配对饲养,自由饮水摄食。饲养环境温度为24℃,湿度为50%,明暗周期为7:00至19:00。实验开始前1周,实验者每天抚摸小鼠(3min/只)。所有行为实验均在白天进行,实验操作遵照美国国立卫生研究院NIH的《国家实验动物健康与管理条例》。实验时随机将小鼠分成溶媒组和DHK组,每组9只,其中对溶媒组进行侧脑室注射PBS(1μL/只),DHK组侧脑室注射DHK[6.25μmd/(L·只)],并于给药后30min以及其后24h分别进行1次旷场实验。

1.2侧脑室置管及微量给药

小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(65mg/kg),待其麻醉后固定于脑立体定位仪上,暴露颅骨并标记前囟点,以前囟点为原点将导管(62202型,瑞沃德生命科学有限公司)向后0.3mm、向右1.0mm、向下2.5mm植入右侧脑室。手术后,小鼠单笼饲养恢复5～7d。实验结束后,组织解剖发现每组1只导管位置错误,其数据被剔除。

DHK(abcam,cambridge,UK)溶于0.01MPBS(pH7.4)侧脑室微量给药。在小鼠清醒状态下用毛巾轻微束缚进行,用微量注射泵通过引导管向侧脑室注射DHK[6.25nmol/(μl/只)]或PBS缓冲液(1μl/只),注射速度为0.5μl/min[15]。

1.3旷场实验

旷场测试是在1个长宽高为50cm×50cm×60cm的方形黑色聚乙烯的隔音箱中进行。箱子的底部被平均分割成25(5×5)个格子,将中央16(4×4)个格子所组成的区域定义为中央区域[16]。实验时,将小鼠置于箱子中自由探索10min。通过箱顶摄像头记录小鼠行为并由熟练者双盲统计小鼠直立时间(两只前爪全部离地)、理毛时间、进入中央区域的时间以及小鼠穿越格子数。两组小鼠进行连续2天的旷场测试,每天各10min。在第1次旷场测试(OFT1)前30min小鼠侧脑室注射DHK或溶媒,OFT1后24h进行第2次旷场测试(OFT2),观察2次旷场测试中小鼠理毛时间、进入中央区时间和穿越格子数。

1.4统计学处理

实验数据采用sigmastat3.5软件处理,组间比较使用非配对t检验,实验数据用(mean±SE)表示,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1DHK注射30min后对小鼠OFT1焦虑行为的影响

在OFT1阶段,非配对t检验表明,各组小鼠直立样行为时间比较差异无统计学意义(P>0.05,图1A)。各组小鼠理毛时间比较差异无统计学意义(P>0.05,图1B)。各组小鼠进入中央区时间比较差异无统计学意义(P>0.05,图1C)。此外,各组小鼠穿越的的格子数比较差异无统计学意义(P>0.05,图1D)。

图1DHK注射30min后对小鼠OFT1中焦虑样行为的影响(n=8)

A-DHK注射30min后对小鼠OFT1中直立样行为时间的影响;B-DHK注射30min后对小鼠OFT1中理毛时间的影响;C-DHK注射30min后对小鼠OFT1中进入中央区时间的影响;D-DHK注射30min后对小鼠OFT1中穿越的格子数的影响

2.2DHK注射24h后对小鼠OFT2焦虑行为的影响

在OFT2阶段,非配对t检验表明,各组小鼠直立样行为时间比较差异无统计学意义(P>0.05,图2a)。各组小鼠理毛时间比较差异无统计学意义(P>0.05,图2b)。各组小鼠进入中央区时间比较差异无统计学意义(P>0.05,图2c)。此外,各组小鼠穿越格子数比较差异无统计学意义(P>0.05,图2d)。

图2DHK注射24h后对小鼠OFT2中焦虑样行为的影响(n=8)

(a)DHK注射24h后对小鼠OFT1中直立样行为时间的影响;(b)DHK注射24h后对小鼠OFT1中理毛时间的影响;(c)DHK注射24h后对小鼠OFT1中进入中央区时间的影响;(d)DHK注射24h后对小鼠OFT1中穿越的格子数的影响

3、讨论

既往研究检测了侧脑室分别注射6.25,12.50,25.00mmol/L3种剂量的DHK,30min后对小鼠活动度的影响[15]。结果显示剂量为12.5mmol/L和25mmol/L的DHK小鼠活动度明显降低,而剂量为6.25mmol/L的DHK小鼠的活动度不受影响。鉴于活动度对小鼠焦虑样行为的影响,当前研究选择6.25mmol/μl的DHK检测其对焦虑样行为的影响。旷场测试是一种广泛应用的检测焦虑样行为的方法。小鼠在旷场中的直立样行为、理毛行为和贴壁行为体现了小鼠的焦虑程度,因此,当前研究统计了小鼠直立样行为时间、理毛行为的时间和进入中央区域的时间来衡量小鼠的焦虑样行为。研究发现6.25mmol/L的DHK不影响30min和24h后旷场测试中小鼠的直立样行为时间、理毛时间、进入中央区时间。此外,实验检测了小鼠穿越的格子数,结果显示DHK不影响30min后OFT1中小鼠的穿越的格子数以及24h后OFT2中小鼠穿越的格子数。

有研究表明,在高架十字迷宫模型和恐惧条件化中,DHK中央杏仁核注射(12.5mmol/L)可导致大鼠焦虑样和抑郁样行为[17]。本研究表明侧脑室注射DHK不影响小鼠焦虑样行为。造成这种差异的原因可能是注射区域的不同。有研究表明,缘下皮层注射DHK(0.5mmol/L)在大鼠强迫游泳测试中发挥抗抑郁样作用,并且能激活5-TH1A受体[18]。由于抑郁和焦虑的共病性,以及5-TH1A受体激活参与多种抗焦虑作用,提示缘前皮层注射DHK可能具有抗焦虑样作用。本研究侧脑室注射DHK通过脑脊液的循环药物使DHK到达全脑。但因中央杏仁核和缘前皮层2个部位在焦虑行为中的相反作用,从而使侧脑室注射DHK显现出不影响小鼠焦虑样行为的效果。然而,缘前皮层注射DHK对焦虑行为的改善作用仍缺乏直接证据,今后的研究将验证缘前皮层注射DHK的抗焦虑作用。

研究表明,6.25mmol/L的DHK损害小鼠新颖物体识别记忆获得、巩固和提取[15]。鉴于DHK杏仁核注射诱导小鼠焦虑样行为,因而无法排除是否是DHK诱导焦虑从而损害学习记忆。本研究排除了该剂量DHK对小鼠焦虑样水平的影响,为DHK作为一种新的记忆擦除药物排除其对焦虑情绪的影响提供了证据。然而,1种测试方法难免有局限性,之后的研究将运用高架十字迷宫、黑白箱等检测方式进一步评价DHK对焦虑样行为的影响。

综上所述,DHK注射30min及24h均不影响小鼠在OFT中的直立样行为时间、理毛时间、进入中央区时间和穿越的格子数。

肖楚丽,肖煦晖,彭丽文,谢一铭,肖志勇.谷氨酸转运体抑制剂DHK对小鼠焦虑样行为的影响[J].邵阳学院学报(自然科学版),2020,17(02):101-105.

基金:湖南省自然科学基金(2019JJ50548.