土壤盐碱化在世界范围内分布广泛,已成为全球环境问题[1]。我国盐碱土总面积约0.9913亿hm2,主要分布在华北、东北、西北及沿海地区[2],是造成全球土地退化和影响土壤高效利用的主要原因之一[3]。盐碱胁迫会导致土壤渗透势下降,离子平衡失调,从而影响植物对离子的吸收,抑制植物的生长发育[4]。目前为止,人们对于盐碱胁迫的研究重点在农业和草业方面,林木耐盐碱研究所占的比例甚少[5],或者主要研究单盐和单碱对植物生长发育影响[6]。流苏(Chionanthusretusus)为木犀科流苏树属落叶小乔木或灌木,产于甘肃、陕西、山西、河北、河南以南至云南、四川、广东、福建、台湾[7]。开花时花密,花形秀丽,如白雪般缀满枝头,是良好的园林观赏树种。现今国内外对流苏树的研究多集中在繁殖技术[8,9,10,11]、抗逆性[12,13,14,15,16,17,18]、药用价值[19]等方面。在抗盐碱方面多集中于对不同盐浓度下流苏树种子发芽率及流苏树抗盐生理机理等方面。张建锋等[15]利用质量分数w(NaCl)∶w(NaCl+KCl)=1∶1对流苏的种子分别做不同质量分数的盐分处理。该试验结果表明,流苏具有一定的耐盐能力,在质量分数为0.4%盐分下,发芽率均在80%以上;随着盐分质量分数的提高,种子发芽率逐渐下降。姚琳等[16]、冯蕾等[17]、王鑫等[18]分别对流苏树的抗盐生理机理进行了研究,表明了流苏具有一定的耐盐力。从已有的植物抗盐碱生理研究来看,以单盐NaCl的研究颇多,本试验用NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO34种盐混合,模拟自然界盐碱地生态环境,探讨了流苏幼苗对混合盐碱胁迫的生理响应特性及机制,以期为植物耐盐碱种质资源提供参考,为流苏树向盐碱地区的推广应用提供科学依据。

1、材料与方法

1.1 材料

供试材料为2年生流苏播种苗,于2016年3月份将未展叶的流苏幼苗从苗床起出,栽植于18cm×16cm的黑色育苗袋中,栽培基质由V(园土)∶V(珍珠岩)∶V(蛭石)∶V(营养土)=2∶2∶2∶1配置而成,每盆土壤质量1.5kg,栽植1株。土壤密度为1.37g·cm-3,含水量为73.75%,pH值为6.97,全氮、全磷、全钾质量分数分别为1.06、0.92、0.71g·kg-1。移栽后置于荫棚,正常管理4个月。于2016年7月份,选择生长健壮,长势基本一致的小苗进行试验处理。

1.2 试验设计

试验在南京林业大学园林实验教学示范中心(118°49′E,32°30′N))内进行。将NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO34类盐按不同摩尔比混合,分成3个处理组(分别用A、B、C、表示),每组内又设4个处理,其混合总浓度分别为50、100、200、300mmol·L-1,共模拟出12个混合盐碱组合(表1),另设置蒸馏水为对照组。共12个处理,每个处理选50株苗,重复3次。

A处理组代表轻度碱胁迫(pH<8.45),B处理组代表中度碱胁迫(8.45≤pH<9.50),C处理组代表重度碱胁迫(pH≥9.50);总盐浓度亦分为低盐浓度(50、100mmol·L-1)、中盐浓度(200mmol·L-1)、高盐浓度(300mmol·L-1)。

2016年7月1日将流苏幼苗移入温室中,适应一个星期后进行胁迫处理,每个处理选50株苗,重复3次,用1.5L盐溶液充分透灌,使植株完全处于胁迫状态,并在种植袋下垫一个托盘,将渗出的溶液倒回袋中。为防止浇盐过多幼苗出现的冲击效应,将处理盐溶液3次浇灌。胁迫初始浇灌500mL,之后的第14、28天各补500mL。胁迫42d后,采取功能叶片进行指标测定。

1.3 试验方法

盐害症状调查:根据盐碱胁迫对流苏的伤害程度,参考王琪等[20]的评价体系,将流苏的外部形态变化分为5个等级(表2)进行评价分析。盐害指数计算公式为:

生理指标的测定:电导率采用电导仪法[21]测定;丙二醛(MDA)质量摩尔浓度采用硫代巴比妥酸TBA显色法测定;可溶性糖质量分数采用蒽酮比色法测定;脯氨酸质量浓度采用酸性茚三酮显色法测定;超氧物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)法测定;叶绿素质量分数采用乙醇-丙酮混合液浸泡法测定[22]。

1.4 数据处理

运用Excel2010管理数据,绘制图表,SPSS19.0进行显著性和相关性分析。

2、结果与分析

2.1 流苏盐害症状调查

根据流苏幼苗在盐碱胁迫过程中的形态变化,将盐害症状分等级进行评价,得到盐害指数,如表3所示。随着盐碱胁迫的加重,流苏的外部形态表现为叶片脱落越来越严重,最后全部脱落,接近死亡。其中,在低盐浓度(50、100mmol·L-1)胁迫下,尽管pH值不断增大,只有C处理组,流苏盐害症状超过了50%;而在轻度碱胁迫下,在中高盐浓度(200、300mmol·L-1)流苏叶片盐害指数均在90%以上,说明超过流苏所能承受的耐盐范围,对植株造成不可逆的伤害,可以推测出高盐浓度对流苏生长影响更大。

如表3所示,从流苏幼苗存活率来看,300mmol·L-1时,所有碱性盐处理组的流苏幼苗死亡率大于50%,B、C处理组,死亡率均超过60%,说明高盐分和高pH值对流苏幼苗的损伤程度都很大。

2.2 盐碱胁迫对流苏幼苗叶片生理性状的影响

2.2.1 盐碱胁迫对流苏幼苗叶片相对电导率的影响

如表4所示,随着盐碱胁迫加重,流苏叶片相对电导率均呈增加趋势,且显著高于对照组。B、C处理组各浓度处理胁迫下的相对电导率均达到50%以上,说明盐碱胁迫已经超过了流苏的半致死范围;在300mmol·L-1时,轻度碱性盐处理组的流苏相对电导率骤然增加,中度碱性盐胁迫增幅较平缓。

2.2.2 盐碱胁迫对流苏叶片丙二醛(MDA)质量摩尔浓度的影响

如表4所示,随着盐碱胁迫的加重,流苏叶片丙二醛质量摩尔浓度均呈整体增加趋势,且高于或显著高于对照。其中,A处理组在100mmol·L-1时达到最大值,分别为对照组的7.01倍,随后流苏叶片丙二醛质量摩尔浓度下降,说明流苏具有一定的抗盐能力;C处理组在50mmol·L-1达到最大值,分别为对照组的3.26倍,说明无论是高浓度盐还是高pH值胁迫,对流苏丙二醛质量摩尔浓度影响严重。

2.2.3 盐碱胁迫对流苏叶片脯氨酸质量浓度的影响

如表4所示,随着盐碱胁迫的加重,各处理组流苏叶片脯氨酸整体呈增加趋势,但期间有波动,流苏叶片脯氨酸质量浓度均高于或显著高于对照。A、C处理组内的流苏叶片脯氨酸质量浓度呈递增趋势,B处理组内的流苏叶片脯氨酸质量浓度呈“M”形变化。其中,A组盐浓度为100mmol·L-1时流苏脯氨酸质量浓度稍有降低,仍显著高于对照,说明流苏适应性增强,细胞渗透势下降,细胞质浓度降低,细胞有机渗透调节物质减少;B处理组内在盐浓度为50mmol·L-1时达到最大值,比对照组增加了56.7%。

2.2.4 盐碱胁迫对流苏叶片可溶性糖质量分数的影响

如表4所示,随着盐浓度的增大,所有处理组的叶片可溶性糖质量分数整体呈增加趋势,期间有波动,均与对照组差异显著。其中,A处理组在浓度200mmol·L-1时显著增加,C处理组当盐浓度为50～200mmol·L-1时流苏叶片可溶性糖质量分数增加平缓,为300mmol·L-1时显著增加。低盐浓度(50、100mmol·L-1)、中盐浓度(200mmol·L-1)、高盐浓度(300mmol·L-1)碱性盐处理的流苏叶片可溶性糖质量分数均随pH值的增大不断积累,但高盐浓度(300mmol·L-1)时,A、B处理组流苏叶片可溶性糖质量分数稍有减少,也许是高盐浓度胁迫使过多的Na+贮存在叶部,导致分化糖的酶活性增大,以至储存的糖分降解;推测高pH碱性盐胁迫对流苏的抑制作用更大。

2.2.5 盐碱胁迫对流苏叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响

如表4所示,各处理组在盐浓度为50mmol·L-1时,流苏叶片SOD活性迅速增大,随着盐浓度的增大SOD活性趋势不同。其中,A处理组,随着盐浓度的升高,流苏叶片SOD活性呈“上升-下降-上升”的趋势,盐浓度为100mmol·L-1时流苏SOD活性低于对照,比对照减少了22.8%;其余均高于对照组,说明SOD起到了保护细胞膜结构的作用。C处理组中,在中高盐浓度显著下降,说明盐分胁迫对流苏产生了一定伤害的作用。

2.2.6 盐碱胁迫下流苏叶绿素质量分数的变化

如表4所示,随着盐浓度增大,各处理组流苏叶片叶绿素质量分数呈现“上升-下降”趋势,均显著高于对照组。其中,A、B、C处理组下,流苏叶片叶绿素质量分数分别在盐浓度为200、100、100mmol·L-1时达到最大值,分别是对照组的7.06、5.03、6.11倍。300mmol·L-1时,流苏叶片叶绿素质量分数变化随pH值的升高而上升。

2.2.7 盐碱胁迫下流苏各指标的相关性

如表5所示,不同盐分和处理组(pH值)及二者间的交互效应对相对电导率、丙二醛质量摩尔浓度、脯氨酸质量浓度、可溶性糖质量分数、SOD活性、叶绿素质量分数的影响均达到了显著水平(P<0.05)。其中,处理组(pH值)对丙二醛质量摩尔浓度、脯氨酸质量浓度、可溶性糖质量分数的影响高于盐浓度,而对其他指标来说盐分的效应大于处理组(pH值)。

本研究在盐碱胁迫42d后,对测定的6个流苏幼苗生理生化指标的相关性进行分析。由表6可知,丙二醛质量摩尔浓度分别与相对电导率、脯氨酸质量浓度、可溶性糖质量分数呈极显著正相关;脯氨酸质量浓度、可溶性糖质量分数均与相对电导率、丙二醛质量摩尔浓度、SOD活性呈极显著正相关;叶绿素质量分数与相对电导率、丙二醛质量摩尔浓度、脯氨酸质量浓度、可溶性糖质量分数、SOD活性呈显著正相关。用多个生理生化指标对流苏进行抗盐碱综合评价,可以避免各指标间所提供的信息出现重叠和疏漏。

3、结论与讨论

植物的外部形态对盐碱胁迫较敏感,可作为判断植物受盐碱胁迫程度的指标[23]。本试验研究结果表明,流苏在低浓度盐胁迫下表型性状变化较小,即使pH值增大,也只有少部分叶片脱落,而在中、高浓度盐胁迫下,受害程度明显增加,说明盐浓度对流苏外部形态的影响大于pH值,这与对2个芍药的品种研究结果一致[20]。

前人研究,植物在遭受胁迫时,胞膜透性变大引发植物体内代谢失调,产生有毒物质,对植物造成损伤,植物的耐盐碱能力可以通过膜系统的稳定性判断,健全的细胞膜结构和正常的功能决定其支配细胞渗透调节物质和离子正常进出细胞[24]。盐碱胁迫对植物叶片细胞膜的选择透过性破坏,直接导致细胞中电解质大量外渗,使得电导率增大[25]。如薛菲等[25]对胡枝子、李玉梅等[26]对牛叠肚的盐碱胁迫研究表明,盐碱胁迫使叶片相对电导率升高。本研究中,随着盐碱胁迫的加重,流苏幼苗相对电导率呈现出增加趋势,并均显著高于对照组。在300mmol·L-1时,轻度碱性盐处理组的流苏幼苗相对电导率骤然增加,中高度碱性盐胁迫增幅较平缓。初步表明,流苏对盐碱逆境具有一定的适应性,但随盐碱胁迫高于某浓度时,相对电导率明显增大,表明伤害加深。丙二醛是膜脂过氧化的产物,会使细胞膜的结构受到损伤,致使膜透性增大或功能丧失,使细胞内的大部分水溶性物质外渗,而外部的Na+大批进入,致使细胞内的离子失衡[27]。丙二醛质量摩尔浓度越高,说明质膜受损越重,本研究中,流苏丙二醛质量摩尔浓度呈整体增加趋势,期间有波动,这与李玉梅等[26]的研究一致。有关丙二醛质量摩尔浓度下降,大概是流苏有较强的抗氧化能力,能避免细胞膜受损害,而随后的回升,才是细胞膜受害的症状。

渗透调节是植物増强抗性的重要方式,也是其减缓盐碱胁迫的重要手段,脯氨酸和可溶性糖是植物体内重要的渗透调节物质[28]。本研究中,随盐碱胁迫的加重,流苏通过增大脯氨酸质量浓度以适应盐碱处理。处理结束后,各处理流苏脯氨酸质量浓度有所下降,但仍显著高于对照,且同一处理组中,流苏脯氨酸质量浓度并没有随盐分的增大而增多,而同一盐浓度则随pH值的升高而增大。说明盐浓度对流苏脯氨酸质量浓度的影响较大,碱胁迫由于呈碱性,可能会中和部分脯氨酸,造成同一处理组,流苏脯氨酸质量浓度变化规律性不强,与绒毛白蜡的结果相一致[29]。本研究中,流苏可溶性糖质量分数随盐碱程度的加重整体呈上升趋势。高盐(300mmol·L-1)胁迫的A、B组,流苏叶片可溶性糖质量分数稍有减少,原因在于高盐浓度时,过量的Na+被贮存在叶部,导致分解糖的酶活性大增,糖分快速分解,同金山绣线菊的研究结果相一致[30]。

植物体内存在活性氧(ROS)消除系统,包括SOD、POD等,细胞正常代谢情况下,该系统处于平衡状态[31]。当植物受到盐胁迫时,活性氧大量产生,打破了活性氧代谢平衡,使诱导保护酶SOD等的活性大幅升高,从而加强了活性氧的清除[32]。但是在盐碱胁迫条件下,常因物种、品种、胁迫类型、胁迫时间等因素的不同,抗氧化酶系统呈现出不同的响应特征。江萍等[33]研究桃叶卫矛时发现,其体内SOD活性均随盐分的增加而先升再降,其中SOD活性相对较高。陈俊[34]在研究混合盐碱处理对碱地肤抗氧化酶活性影响时发现,SOD活性均增强;低盐浓度下,SOD活性上升,高盐浓度时下降,碱胁迫(pH值)对SOD活性起抑制作用。吴成龙等[35]研究碱性盐对菊芋抗氧化作用的影响时发现,SOD活性随处理的加重而先升再降,且与丙二醛质量摩尔浓度呈显著负相关,得出SOD在清除活性氧方面占主要地位。本研究中,各处理组在50mmol·L-1浓度时,流苏叶片SOD活性迅速增大,随着盐浓度的增大SOD活性趋势不同。说明低浓度盐碱胁迫条件下,流苏叶片可通过自身调节机制,诱导增强SOD活性来保护细胞膜免受伤害,而盐碱胁迫程度超出自身调节能力后,其SOD活性则不同程度地降低,说明流苏保护酶系统的平衡被打破,这与前人的研究结果相一致[29]。

盐碱处理有利于叶绿素酶的活性增强,致使叶绿素分解,其质量分数随胁迫的加重而降低[36]。本研究中,流苏叶绿素质量分数大致随盐碱处理的加重先增后降。在低盐、轻度碱处理时,流苏叶绿素质量分数均高于对照,随着盐分、pH值的增大,叶绿素质量分数迅速减少,说明低盐分轻度碱性盐有助于流苏叶绿素的合成,高盐高碱抑制叶绿素的合成,与前人研究结果一致[20,30]。在低盐(50、100mmol·L-1)轻度碱(A处理组)胁迫下,流苏叶绿素质量分数均高于对照,低盐时,流苏叶绿素质量分数上升,随着盐分、pH值的增加,叶绿素质量分数迅速减少,说明低盐、低碱有助于流苏叶绿素的产生,高盐高碱抑制叶绿素的生成。

混合盐碱胁迫并不是盐、碱两种胁迫的简单叠加,而是有一定协同效应[32]。在本研究中,在低盐浓度(50、100mmol·L-1)时,pH值虽然增大,但叶片盐害症状、相对电导率、叶绿素质量分数变化均不明显,说明单纯碱胁迫作用小;在轻碱浓度时(A处理组),随着盐浓度的增大,流苏叶片脯氨酸质量浓度、可溶性糖质量分数变化幅度不大,说明单纯盐胁迫作用也较小。当盐碱共同胁迫时,盐害症状B、C处理在200、300mmol·L-1的盐害症状为100%,说明盐与碱的协同效应会对植物造成更大的伤害。

综上研究表明,流苏在低盐轻碱条件下可以良好生长,在中盐(200mmol·L-1)、pH≥8.45会对流苏造成较大影响。且盐浓度和处理组(pH值)以及二者的交互效应对各生理指标均达到显著水平,盐与碱的协同作用使胁迫产生叠加效应,加重了危害的程度。

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基金:国家林业局“948”项目(2014-4-17);江苏高校品牌专业建设工程资助项目(PPZY2015.A063).