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ALAS2对线粒体自噬受体BNIP3L及K562细胞红系分化的影响

2020-10-21 175 上传者：管理员

摘要：目的:探讨下调亚铁血红素合成酶(ALAS2)对线粒体自噬受体BNIP3L的作用及对K562细胞红系分化的影响。方法:通过慢病毒转染干扰ALAS2的表达，实时荧光定量PCR鉴定转染效率。采用流式细胞术检测K562细胞凋亡、细胞分化、线粒体膜电位、活性氧(ROS)水平，氯化血红素诱导K562细胞红系分化;蛋白免疫印迹法检测BNIP3L的表达。免疫共沉淀检测ALAS2与BNIP3L蛋白的相互作用。结果:与病毒空载对照组比较，ALAS2干扰组的BNIP3LmRNA和蛋白表达下降(P<0.01)，转录因子GATA1、Nrf2表达下调，活性氧水平降低(P<0.05)。病毒空载对照组线粒体膜电位低于ALAS2干扰组(P<0.05),2组的细胞凋亡率无明显差异。氯化血红素诱导细胞分化96h,ALAS2干扰组BNIP3L表达增加且高于病毒空载对照组，病毒空载对照组和ALAS2干扰组的CD71highCD235ahigh+CD71lowCD235ahigh细胞比例分别为53.5%和92.9%。ALAS2与BNIP3L蛋白无直接相互作用。结论:细胞内亚铁血红素水平影响BNIP3L表达，这可能与活性氧及转录因子的调节有关。BNIP3L低表达能减少细胞凋亡，而高表达则有利于红系分化。

关键词：
ALAS2
BNIP3L
K562细胞
亚铁血红素合成酶
活性氧
生理学
红系分化
细胞凋亡
转录因子
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ALAS2是亚铁血红素合成的关键酶，通过增加血红蛋白的合成以促进造血细胞分化[1]。GATA1是红系特异转录因子，可以调控ALAS2和珠蛋白的转录[2,3]。线粒体自噬是细胞选择性降解胞内受损或老化的线粒体，减少细胞内活性氧的产生，以维持细胞稳态的过程。在晚期红细胞成熟过程中，线粒体自噬对清除网织红细胞内残留的线粒体发挥重要作用，此过程主要由线粒体自噬受体BNIP3L(也称Nix)介导[4,5]。文献报道，在红系分化过程中，β地中海贫血的线粒体自噬水平高于正常对照组[6]。本课题组前期研究也发现，ALAS2可影响BNIP3L的表达，然而尚未有亚铁血红素合成与线粒体自噬作用机制的相关报道。K562细胞是慢性髓细胞性白血病来源的细胞株，β珠蛋白表达缺陷，主要表达γ珠蛋白，具有造血祖细胞特性，可被多种化学物质如氯化血红素诱导向红系分化，是研究细胞分化常用的细胞模型[7,8]。因此，本研究通过慢病毒转染下调ALAS2的表达，初步探讨ALAS2对BNIP3L表达的作用及对K562细胞红系分化的影响。

1、材料和方法

1.1试剂与仪器

RPMI1640培养液、胎牛血清均购自广州永津生物科技有限公司(美国Gibco品牌);嘌呤霉素购自广州永津生物科技有限公司(索莱宝品牌);氯化血红素购自上海麦克林生化科技有限公司;RIPA蛋白裂解液、活性氧检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司;AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂为中国南京凯基生物公司产品;蛋白BCA定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司;兔抗人ALAS2抗体、鼠抗人β-actin抗体、兔抗人BNIP3L抗体均购自上海优宁维生物科技股份有限公司(美国CST品牌);羊抗兔、羊抗鼠二抗均购自北京锐抗生物科技有限公司;RNA提取试剂RNAisoplus、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒均购自广州瑞真生物技术有限公司(日本TaKaRa品牌);免疫共沉淀试剂盒购自上海毕傲图生物科技有限公司(美国Bimake品牌);PCR引物由广州艾基生物技术有限公司合成;ALAS2干扰及对照慢病毒载体由汉恒生物科技(上海)有限公司包装;实时荧光定量PCR仪(RocheLightCycler96)为瑞士Roche公司产品;多功能酶标仪(Bio-TekSYNERGYH1)为美国伯腾仪器有限公司产品;倒置荧光显微镜为日本Olympus公司产品;流式细胞仪为美国BectonDickinson公司产品。

1.2细胞培养

慢性髓系白血病K562细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。K562细胞株悬于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养，每48-72h进行换液与传代。

1.3慢病毒转染与稳定转染细胞株的嘌呤霉素筛选

取对数生长期的K562细胞于24孔板，根据预实验确定合适的感染复数MOI=70，每孔板细胞加入相应体积的病毒液，共培养24h后收集细胞，并置于倒置荧光显微镜下观察，评估转染效率。转染72h后，加入终浓度为1μg/ml的嘌呤霉素(溶于二甲基亚砜)，筛选10-14d。

ALAS2、BNIP3L、转录因子mRNA表达的实时荧光定量PCR检测

采取TRIzol法提取总细胞的RNA，分光光度计法检测各组细胞的RNA纯度及浓度，按照逆转录试剂盒说明书步骤将RNA逆转录为cDNA。随后进行聚合酶链式扩增反应，采用“两步扩增法”:95℃预变性30s，然后90℃变性10s,60℃延伸30s，总共进行40个循环。以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。引物的序列见表1。

1.4细胞凋亡、活性氧与线粒体膜电位的流式细胞术检测

细胞凋亡的检测按照试剂盒说明书要求进行检测。450×g离心5min收集细胞，PBS洗涤2次，加入400μl结合缓冲液重悬细胞，分成2管，一管加入5μlAnnexinV-FITC，避光孵育15min后再加入10μlPI，另一管不加入任何试剂作空白对照，混匀上流式细胞仪检测。

活性氧的检测离心收集细胞，PBS洗涤2次，加入按比例1∶1000稀释含DCFH-DA的无血清培养液，37℃细胞培养箱内孵育20min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，上流式细胞仪检测。

线粒体膜电位的检测按照说明书配置JC-1染色工作液，离心收集细胞，重悬于0.5ml细胞培养液，加入0.5mlJC-1工作液，混匀于37℃孵育20min。孵育结束，600×g离心3-4min，沉淀细胞，弃上清，用JC-1染色缓冲液洗涤2次，再用适量的JC-1染色缓冲液重悬细胞，上流式细胞仪检测。

1.5氯化血红素诱导细胞红系分化，BNIP3L表达的蛋白免疫印迹法检测

分别向病毒空载对照组和ALAS2干扰组加入40μmol/L氯化血红素，诱导K562细胞向红系分化。于分化的0、24与96h收集2组细胞，用PBS洗涤2次，加入RIPA裂解液，冰上裂解细胞30min,4℃、12000×g离心15min。BCA定量法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸变性，取30μg蛋白样品进行10%SDS-PAGE电泳分离90min，转到PVDF膜进行电转60min，然后加入5%牛血清白蛋白室温封闭1h。封闭结束，加入目的基因的一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜4次，每次7min，加入二抗室温孵育1h,TBST洗膜4次，应用ECL发光液显色，保存条带，ImageJ软件进行灰度值分析。

1.6细胞分化率的联苯胺染色、流式细胞术检测

为比较2组细胞的分化率，40μmol/L氯化血红素诱导分化的0、24与96h收集细胞，进行联苯胺染色，流式检测CD71与CD235a的表达。向细胞加入0.4%浓度的的联苯胺染色液(溶于12%的乙酸溶液)室温避光染色5min，再加入1%的过氧化氢溶液染色5min，倒置荧光显微镜下观察并计数染色阳性的细胞(染成蓝黑色)。按照说明书向细胞加入CD71-FITC和CD235a-APC抗体(eBioscience)避光孵育，上机进行流式检测，结果用Kaluza软件进行分析。

1.7免疫共沉淀

根据说明书进行操作，500×g、4℃离心10min，收集细胞，PBS洗涤2次，加入300μl结合缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解10min,14000×g、4℃离心10min，收集上清。结合缓冲液稀释抗体配制抗体工作液，加入磁珠至抗体工作液，山羊抗-IgG用作阴性对照，使抗体吸附于免疫磁珠。加入制备好的蛋白样品与磁珠-抗体复合物充分结合，4℃孵育过夜。将吸附抗原的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离，收集上清液，加入上样缓冲液煮沸变性，然后进行SDS-PAGE检测。

1.8统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05示差异有统计学意义。

2、结果

2.1ALAS2表达下调对BNIP3L、转录因子表达的影响

设计并构建了3个ALAS2干扰序列，经过实时荧光定量PCR证明，HBLV-h-ALAS2-shRNA3-mCherryPURO序列可有效下调ALAS2的表达，BNIP3L表达亦下调，差异有统计学意义(P<0.01)。ALAS2表达下调后，转录因子GATA1、Nrf2、Bach1mRNA表达均减少，尤以Nrf2的减少为甚(P<0.05)(图1)。

2.2ALAS2表达下调对细胞凋亡、线粒体膜电位、活性氧的影响

病毒空载对照组与ALAS2干扰组细胞凋亡率分别为6.6%和5.6%，差异没有统计学意义(P>0.05),ALAS2表达下调对细胞凋亡无明显影响。

线粒体膜电位降低，即线粒体去极化引起线粒体自噬的发生。线粒体膜电位的高低用绿色荧光与红色荧光的比值来表示。检测结果表明，病毒空载对照组的线粒体膜电位明显低于ALAS2干扰组(P<0.05)。这提示，ALAS2表达下调后线粒体去极化程度减轻，线粒体自噬水平下降。

干扰ALAS2的表达后，细胞活性氧含量从7945.5下降到1376.0，细胞的活性氧水平明显下降(P<0.05)。因亚铁血红素具有氧化性，细胞内血红素水平过高产生过多的活性氧，对细胞产生氧化损伤。因此，ALAS2表达下调，胞内亚铁血红素合成减少，减少细胞内活性氧水平(图2)。

2.3氯化血红素诱导细胞分化后BNIP3L表达的变化

两组细胞经40μmol/L氯化血红素诱导向红系分化。在诱导分化的0、24、96h，病毒空载对照组BNIP3L表达逐渐降低，而ALAS2干扰组BNIP3L表达逐渐增加。ALAS2下调能减少BNIP3L表达，而外源性补充血红素可以促进BNIP3L的表达。因此，ALAS2对BNIP3L表达的影响是可逆的，BNIP3L的表达可能与细胞内的亚铁血红素水平相关(图3)。

2.4两组细胞分化率的比较

40μmol/L氯化血红素诱导K562细胞向红系分化。诱导分化前两组细胞的分化率无明显差异;而在诱导分化的96h，病毒空载对照组的联苯胺染色阳性细胞率为23.0%，低于ALAS2干扰组的联苯胺染色阳性细胞率52.0%。流式细胞术检测病毒空载对照组和ALAS2干扰组CD71highCD235alow、CD71highCD235ahigh、CD71lowCD235ahigh细胞比例分别为34.0%、45.2%、8.3%和5.1%、78.4%、14.5%。因此在诱导分化的96h，病毒空载对照组的细胞分化率高于ALAS2干扰组，差异具有统计学意义(P<0.05)(图4)。

2.5免疫共沉淀

在阴性对照组排除了非特异性结合的基础上，免疫共沉淀结果表明，ALAS2蛋白对BNIP3L蛋白并无直接作用(图5)。

3、讨论

红系分化过程的进行，既需要合成足够的亚铁血红素和珠蛋白，亦需要线粒体自噬的参与。然而，亚铁血红素的合成与线粒体自噬水平是否存在调节作用，仍缺乏相关的研究和文献报道。本研究通过病毒转染下调ALAS2的表达及外源性增加血红素，探讨细胞内亚铁血红素水平对线粒体自噬受体BNIP3L表达的作用及对红系分化的影响，期望可以为促进造血干细胞的分化，改善造血障碍相关性疾病的贫血症状提供新的治疗方向[7]。

造血干细胞的分化成熟是蛋白合成酶和众多转录调节因子共同参与、精密调控的过程。ALAS2是亚铁血红素合成的关键酶，ALAS2基因发生突变可以导致人患遗传性铁粒幼细胞贫血(XLSA)[8]。GATA1是红系特异性的转录调节因子[9]。文献报道，GATA1既参与调节ALAS2的转录，亦参与调节珠蛋白的转录[10,11]。本研究结果显示，ALAS2表达下调后，转录因子GATA1mRNA的表达亦减少，提示细胞内亚铁血红素水平可能通过GATA1影响珠蛋白的转录[12,13]。

自噬是真核细胞通过溶酶体途径将细胞内的生物大分子、老化细胞器及外来物质降解为小分子氨基酸、脂肪酸供细胞重新利用的过程[14,15]。线粒体自噬属于一种选择性自噬，是细胞将胞内受损或老化的线粒体清除的过程。在红细胞分化的晚期阶段，细胞主要通过线粒体自噬清除网织红细胞内残留的线粒体，进而促进红细胞的成熟，此过程主要是由位于线粒体外膜上的受体蛋白BNIP3L介导。线粒体自噬对红细胞分化发挥重要的作用[16]。研究发现，BNIP3L表达缺陷的造血干细胞不能正常分化为成熟红细胞，动物实验亦证明BNIP3L表达缺失的小鼠发生贫血，甚至出现死亡[17,18,19]。因此，BNIP3L对红系分化的作用不可或缺。本研究还发现，补充氯化血红素可以增加BNIP3L的表达，促进K562细胞向红系分化。因此，亚铁血红素不仅参与血红蛋白的合成，还可以通过线粒体自噬途径影响晚期红系分化。

本研究表明，ALAS2表达下调对细胞的凋亡无明显影响。线粒体膜电位降低是线粒体去极化的前提条件，是细胞发生早期凋亡的一个标志性事件。ALAS2干扰组的线粒体膜电位水平高于病毒空载对照组，提示ALAS2表达下调有潜在保护细胞免受凋亡的作用。细胞内亚铁血红素合成减少，可能通过降低BNIP3L的表达，减少细胞凋亡。

亚铁血红素具有氧化性，细胞内亚铁血红素含量过高可对细胞造成氧化损伤[20]。转录因子Nrf2是氧化感受器，氧化应激状态下，Nrf2表达增加，保护细胞免受损伤，Bach1是Nrf2的拮抗剂，两者具有协调作用维持细胞稳态[21,22]。氧化应激条件下，细胞也可通过增加线粒体自噬清除受损的线粒体，减少活性氧的产生，对细胞起到保护作用。文献报道，活性氧可能是线粒体自噬的诱发因素[23]。β地中海贫血由于β珠蛋白合成减少，冗余的α珠蛋白沉积于细胞膜上形成“包涵体”，细胞变形性降低，与输血导致的铁过载等因素共同作用，使细胞氧化应激水平升高，早期红细胞凋亡增多，导致“应激造血”状态[24,25,26]。本课题组前期研究发现，β地中海贫血的线粒体自噬水平较正常对照组升高，推测可能与β地中海贫血的氧化应激状态有关[27,28]。本研究结果显示，ALAS2表达减少引起活性氧水平下降，线粒体自噬受体BNIP3L表达亦下调，而ALAS2并非通过直接作用影响BNIP3L蛋白的降解或移位，可能的调控机制是:亚铁血红素合成减少，细胞内的活性氧产生减少，引起转录因子Nrf2/Bach1表达下调，进而影响BNIP3L的表达水平。亚铁血红素介导的活性氧的产生可能是影响线粒体自噬的一个重要因素。

为进一步了解转录因子GATA1和Nrf2对BNIP3L表达的作用，本课题组查阅了UCSC和JAS-PAR数据库，对GATA1、Nrf2与BNIP3L的结合位点进行预测。结果发现，GATA1、Nrf2均与BNIP3L的启动子区域可能存在结合位点。GATA1、Nrf2与BNIP3L启动子区域结合的预测序列分别是GTA-ATCTTGGTGTGACTG和ATGTTTCAGCA，预测得分为6.9与8.0,BNIP3L表达下调可能是转录因子GATA1与Nrf2作用的结果。

综上所述，本研究通过干扰ALAS2的表达减少亚铁血红素的合成，外源性补充血红素诱导细胞分化实验，证明了细胞内亚铁血红素的水平可以影响BNIP3L的表达，调节线粒体自噬进而影响红系分化。通过对转录因子结合位点进行预测分析发现，GATA1与Nrf2均可能参与调控BNIP3L的转录，提示亚铁血红素可能通过影响活性氧水平和转录因子的表达，进而影响线粒体自噬水平。因此，造血干细胞的分化成熟是转录因子GATA1通过调控ALAS2转录，促进亚铁血红素的合成，而细胞内亚铁血红素水平影响线粒体自噬受体BNIP3L表达的过程[29]，调控亚铁血红素的合成为促进红系分化提供了新的手段。

胡舒婷,李欣瑜,陈晗,许吕宏,方建培.干扰ALAS2表达通过下调K562细胞线粒体自噬受体BNIP3L影响红系分化[J].中国实验血液学杂志,2020,28(05):1710-1717.

基金:国家自然科学基金面上项目(81370603);广东省自然科学资金项目(2018A030313526).