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论线粒体对血小板膜蛋白GPIbα酶切的作用机制

2020-10-19 249 上传者：管理员

摘要：目的:探讨线粒体对血小板膜蛋白GPIbα酶切的调控作用和机制。方法:分离健康志愿者外周静脉血血小板，选择破坏或保护血小板线粒体的功能的羰基氰-3-氯苯腙(CCCP)和环胞素A(CsA)、抑制膜蛋白GPIbα酶切的金属蛋白酶抑制剂GM6001、降低细胞内活性氧(ROS)水平的抗氧化剂NAC分别与洗涤血小板共同孵育，应用流式细胞术检测受刺激后血小板线粒体功能的变化对膜蛋白GPIbα酶切的影响。结果:CCCP诱导线粒体内膜两侧膜电位去极化，直接破坏线粒体的呼吸功能;血小板GPIbα的酶切检测发现GPIbα发生酶切，实验结果具有统计学意义。这提示当血小板线粒体功能受损伤时，会伴随出现GPIbα酶切现象;用CsA保护线粒体功能后，血小板GPIbα酶切现象被明显的抑制，实验结果具有统计学意义;而GM6001可以抑制GPIbα的酶切现象，但不影响线粒体的功能，实验结果具有统计学意义。这提示，血小板GPIbα的酶切在线粒体受到了调控。酶切调控酶ADAM17位于线粒体下游的信号通路上，用NAC抑制细胞内出现的氧化损伤，检测血小板受体的酶切变化发现，NAC可以有效地抑制血小板受体的酶切现象，并呈浓度梯度依赖，实验结果具有统计学意义。结论:线粒体功能异常引起血小板膜蛋白GPIbα发生酶切，其机制是源于异常功能线粒体导致胞内ROS代谢失衡，进而诱导酶切的发生。

关键词：
活性氧
生理学
血小板膜蛋白Ibα
酶切
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糖萼蛋白是血小板膜糖蛋白受体GPIbα的膜外部分被酶切以后，存在于血浆中的GPIbα的N端多肽，其由282个氨基酸残基组成，分子量130kDa。GC在正常人血浆中含量较稳定，约为2.04±0.46pg/ml[1]。GC上富含负电荷氨基酸残基的区域可以与细胞外多种重要配体，包括VWF、凝血酶、P-选择素、白细胞黏附分子(CD11b/CD18)、凝血因子XI和XII、以及高分子量激肽原等结合[2]，因此，其重要性不言而喻。血小板GPIbα胞外端被酶切，几十年来一直受到学者们广泛的关注。目前，有研究发现，许多生理、化学刺激或疾病中可监测出血小板GPIbα胞外域发生酶切，这些刺激因素包括:钙离子载体(如:A23187)、巯基修饰试剂、巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(PMA)、过氧化氢(H2O2)，以及在病理性的高剪切力、特发性血小板减少性紫癜、尿毒症和肝硬化[2,3]等疾病中。这些研究结果不仅关注于剪切酶的结构、位置和机制，而且学者们更关注于将GC作为一种生物标记物，用来研究GPIbα酶切受调控方式，评判血小板功能、血小板寿命、血库储存血小板损伤情况，更重要的是用于评判相关疾病的发生发展状态[3,4,5,6,7,8,9]。

血小板活化是指血小板在止血初期过程中发生的粘附、变形、释放、聚集等反应，是血栓形成的重要步骤。血小板凋亡是血小板维持自身平衡的一种途径，可保持体内血小板产生和破坏维持稳态，维持体内血小板的数量平衡。血小板活化和凋亡的异常，可能引起机体出现血栓或止血异常等疾病，是体内血小板执行功能的体现形式。不仅如此，血小板还在炎症、免疫和肿瘤转移过程中扮演重要角色。虽然血小板GPIbα胞外端酶切在血小板生理功能的调控、相关疾病的发生以及血小板储存等过程中起着十分重要的作用，但是其信号转导途径以及GPIbα酶切与血小板功能之间的关系还不是很清楚。因此，本研究将对GPIbα酶切机制进行探讨，研究结果不仅对认识血小板参与的止、凝血过程，还将对血小板储存，肿瘤，感染，外伤和以血栓形成为基本病理特征的中风、心肌梗死等心脑血管疾病等等具有重要的意义。

1、材料和方法

1.入组样本

献血志愿者年龄21-28岁，人新鲜血液，性别不限，体重相近，无既往病史和药物过敏史，精神状态良好，不吸烟，无嗜酒，献血前两周内(14d内)未服用任何药物。

1.2试剂与仪器

抗P-选择素单克隆抗体SZ-2、SZ-51由苏州大学医学院阮长耿教授馈赠;钙离子载体A23187(分子式:C112H132CaMgN8O24),GM6001(分子式:C20H28N4O4)，环孢菌素A(cyclosporinA,CsA)(分子式:C62H111N11O12)均购自美国Sigma公司;FITC标记的羊抗小鼠IgG二抗购自美国SantaCruz公司;Ttramethylrhodamineethylester(TMRE)(分子式:C26H27ClN2O7)购自奥地利BenderMedsystem公司。低速离心机为中国安徽中科中佳科学仪器有限公司生产。电热恒温水浴锅为中国上海精宏实验设备有限公司产品。全自动三分类血液分析仪购自日本Sysmex公司。四维旋转混合仪购自中国江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司。流式细胞仪购自美国Beckman-Coulter公司。

1.3洗涤血小板的制备

取健康自愿者静脉血与ACD(2.5%柠檬酸钠，2.0%葡萄糖，1.5%柠檬酸)按1∶7抗凝，200×g离心20min得到富含血小板血浆，将PRP以1500×g离心20min，弃上清。用CGS缓冲液(0.123mol/L氯化钠，0.033mol/L葡萄糖，0.013mol/L柠檬酸钠，pH6.5)悬浮并离心、洗涤沉淀的血小板，再用修改的Tyrode’s缓冲液MTB(2.5mmol/LHepes,150mmol/L氯化钠，2.5mmol/L氯化钾，1mmol/L氯化钙，1mmol/L氯化镁，12mmol/L碳酸氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，pH7.4)重悬血小板，得到洗涤血小板悬液，用计数板对血小板进行计数，调整血小板数至3×10[8]/ml，室温静置60min。

1.4血小板P-selectin表达的流式细胞术分析

预先接受或无预处理的静置后洗涤血小板与刺激剂，或溶剂对照室温(roomtemperature,RT)孵育指定时间。每管取50μl5×10[7]/ml处理后的洗涤血小板，加入终浓度为5μg/ml的SZ51室温孵育30min，用MTB洗涤1次，用50μl含FITC标记的羊抗小鼠IgG二抗的MTB重悬血小板，在避光条件下室温孵育30min，每管加300μlMTB，上流式细胞仪检测(FACSCalibu,BDBiosciences)。

1.4血小板线粒体膜电位变化的流式细胞术分析

TMRE是具有细胞穿透能力的，阳离子，红黄银光的染料，可以快速的穿透并聚集在正常细胞的线粒体内。当线粒体受到损伤时，细胞线粒体内的荧光聚集减少。取50μl静置后的血小板，刺激时间结束后，加入150μlMTB稀释血小板，按照终浓度100nmol/L加入线粒体膜电位的标记试剂TMRE，避光孵育30min。最后加入200μlMTB补足400μl终体积后，用流式细胞仪检测。

1.5血小板膜糖蛋白GPIbα酶切的流式细胞术分析

样品50μl每管，处理结束后加入5μg/ml的SZ2室温孵育30min,600×g离心2min后，用50μl含FITC标记的羊抗小鼠IgG二抗的MTB重悬血小板，室温避光孵育30min，每管加300μlMTB，用流式细胞仪检测。

1.6统计学分析

SPSS软件对实验数据进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示，不同组之间的比较采用one-wayANOVA进行统计分析，P<0.05示差异有统计学意义。

2、结果

2.1GPIbα酶切与线粒体的相关性

实验结果显示，羰基氰-3-氯苯腙可明显促进血小板线粒体膜电位的去极化(r=0.99)(图1A)，并且同时促进GPIbα的酶切(r=0.99)(图1B)，但不会影响血小板活化指标P-选择素的表达(图1C)。这提示，线粒体可能是血小板酶切重要的调控位点，而CCCP不引起血小板P-选择素的表达，即不引起血小板活化的发生，这提示血小板酶切和活化是相对独立的信号通路。

2.2线粒体对GPIbα酶切作用

为了进一步证明线粒体与血小板膜受体GPIbα酶切的关系，用环胞素A(cyclosporinA,CsA)与血小板共孵育预处理保护线粒体功能(r=0.99)(图2A)，同时检测A23187刺激CsA预处理后，血小板GPIbα酶切(r=0.99)(图2B)和P-选择素表达(图2C)的变化情况。结果显示，CsA保护线粒体功能后，血小板GPIbα受体酶切现象受到明显抑制，而血小板P-选择素表达没有变化。用金属蛋白酶广谱抑制剂GM6001抑制血小板GPIbα酶切的关键蛋白酶去整合素-金属蛋白酶17(adisintegrinandmetallop17,ADAM17)的蛋白活性，检测A23187刺激血小板GPIbα酶切和线粒体的变化。结果显示，GM6001可以抑制GPIbα的酶切(r=0.99)(图2D)，但不影响线粒体的功能(图2E)。实验结果再次证明，血小板上膜受体的酶切在线粒体水平就受到了调控，调控酶ADAM17位于线粒体下游的信号通路上，而且血小板活化与酶切信号是独立存在的。

2.3线粒体下游Caspase-3蛋白对GPIbα酶切的作用

实验结果显示，z-DEVE-fmk预处理血小板后，不能检测到诱导后血小板内Caspase-317kDa活性片段的产生;同时用流式细胞术检测，结果显示血小板线粒体功能(图3A)和GPIbα酶切(图3B)均未出现明显变化。H89刺激ADAM17抑制剂GM6001预处理后的血小板，结果显示，GM6001不影响血小板线粒体的变化(图3C)，但可以有效的抑制GPIbα的酶切现象(r=0.99)(图3D)。这提示，GPIbα酶切信号通路中，ADAM17与Caspase-3的活化无关，均位于线粒体变化的下游。

2.4线粒体影响GPIbα酶切的分子机制

实验结果显示，抗氧化剂NAC(5mmol/L,10mmol/L和20mmol/L)可以有效的抑制血小板受体的酶切现象，并呈浓度梯度依赖(r=0.99)(图4)，结果具有统计学意义．这证明，血小板GPIbα酶切是由于血小板内线粒体功能异常引起的氧化还原失衡所引起的生物学现象。

3、讨论

线粒体呼的吸依赖于电子转移和质子梯度驱动产生的ATP，而在这个过程中也会产生超氧化物阴离子自由基和过氧化氢等活性氧副产品，并释放到胞浆中。活性氧以第二信使身份负责细胞内的信号转导以参与调节生理和病理过程。通常，低浓度的活性氧是细胞生长、生存、信号转导等所必需的胞内信号分子。然而，过量的活性氧会引起氧化应激并引起蛋白质、脂质和DNA发生氧化损伤[10]。血小板中含有少量功能完全的线粒体，虽然目前对线粒体在血小板中的功能还没有明确结论，但已有研究证明，血小板线粒体功能障碍参与调控糖尿病、脓毒症和神经退行性疾病等多种疾病的发生发展过程[11]。

ADAM17分子质量70kda，是锌离子依赖的具有解离素和金属蛋白酶样活性的膜蛋白。2004年，Bergmeier等[12]用ADAM17基因敲除小鼠检测血小板储存条件诱导GPIbα酶切，结果显示，基因敲除小鼠体内血液中GC含量和对照组相比下降了90%，确定了ADAM17在血小板GPIbα的酶切过程中起关键作用。近期有研究证实，GPIbα受体上酶切的位点高度保守，ADAM17酶切GPIbα的位点位于GPIbα胞外近膜端Gly464和Val465之间，可能通过调控ADAM17的酶切活性和调控ADAM17作用底物的结构两种方式，单独或协同调控细胞膜受体的胞外端的酶切程度。但是目前血小板内调控ADAM17的信号途径还不清楚，线粒体功能与血小板受体酶切之前的关系还未有报道。

本研究主要是通过流式细胞术探讨线粒体对血小板膜糖蛋白受体GPIbα酶切的调控作用。首先使用了CCCP进行试验。CCCP可以将线粒体膜上氧化磷酸化呼吸解耦连，促使线粒体内膜对H+产生通透性，导致线粒体内膜两侧的膜电位丧失进而直接影响线粒体的呼吸功能，同时检测GPIbα的酶切变化。研究显示，线粒体功能异常引起血小板膜糖蛋白受体GPIbα发生酶切，结果具有统计学意义。线粒体通透性转换孔是横跨线粒体内外膜形成的通道。MPTP的完全开放会破坏线粒体内膜的完整性，引起离子平衡紊乱，氧化磷酸化解耦联，膜电位去极化，ATP产生下降等现象。CyclophilinD(CypD)是调控MPTP形成的主要调控蛋白。CsA也称Cyclosporine或AntibioticS748F1，是一种常用的免疫抑制剂。CsA与CypD相互作用，可以有效的抑制线粒体膜上MPTP的形成。目前有研究证实，CsA可以有效的抑制A23187诱导血小板线粒体膜上的孔径蛋白形成孔道，起到保护血小板线粒体功能作用[13]。为了进一步证明线粒体与血小板膜受体GPIbα酶切的关系，用CsA抑制线粒体膜上MPTP的形成保护线粒体内膜的完整性。结果发现，血小板GPIbα受体酶切现象明显被抑制了，结果具有统计学意义;而另一方面还发现GM6001可以抑制GPIbα的酶切，但不影响线粒体的功能，结果具有统计学意义。这提示，血小板上膜受体的酶切在线粒体水平就受到了调控，调控酶ADAM17位于线粒体下游的信号通路上。有研究证明，血小板内线粒体膜电位去极化可引起血小板内终末剪切酶Caspase-3蛋白活化，促使血小板发生凋亡。为了进一步明确GPIbα酶切在线粒体调控信号通路中的位置，本研究使用特异的不可逆的Caspase-3抑制剂z-DEVE-fmk预处理血小板和使用可同时诱导血小板发生Caspase-3活化和GPIbα酶切的诱导剂H89，检测血小板内Caspase-3活性变化，同时检测血小板线粒体和GPIbα酶切的变化。实验结果显示，抑制Caspase-3蛋白活性后，血小板线粒体和GPIbα酶切不发生变化，结果具有统计学意义，这证明，线粒体下游caspase-3不参与酶切过程，再次提示，GPIbα酶切在线粒体水平受到调控。活性氧(reactivexygenspecies,ROS)是生物体内氧化反应过程中形成的氧自由基，常见有超氧化阴离子(O2-)，过氧化氢(H2O2)，过氧化自由基(ROO-)和氢氧自由基(OH-)等形式，线粒体的功能受损常导致细胞内氧化还原功能障碍，促使细胞内ROS浓度的升高。本课题组之前的研究证实，H89诱导血小板后会影响胞内线粒体功能，打破胞内氧化还原平衡。为了进一步探明GPIbα酶切与线粒体之间的信号通路，本研究使用ROS抑制剂NAC预处理血小板，抑制血小板内ROS产生造成的氧化损伤后，检测血小板受H89刺激后GPIbα受体的酶切情况，检测结果显示，NAC可以有效的抑制血小板受体的酶切现象，且呈浓度梯度依懒性。这提示，GPIbα酶切在线粒体水平受到调控，机制是源于线粒体功能异常导致胞内ROS产生失衡引发的。综合现有的研究结果发现，血小板受诱导后出现线粒体功能异常→线粒体膜上MPTP形成→ROS水平升高→ADAM17蛋白活化→GPIbα酶切的信号通路。

综上所述，许多生理、化学刺激或疾病状态可引起血小板GPIbα胞外域与GPIbβ连接的二硫键的外侧位点发生酶切产生GC，因为GC可以与多种涉及凝血或炎症等调控蛋白结合，所以，探讨GPIbα酶切的机制，不仅对认识血小板的信号转导过程，对血小板储存、肿瘤、感染，外伤和血栓出血等疾病的病理机制，而且对GC的疾病诊断和症状评估等的临床应用都具有重要的意义。

参考文献:

[2]赵丽丽,阮长耿,戴克胜.血小板膜糖蛋白Ibα受体的酶切机制.血栓与止血杂志,2012,18(3):142-144.

赵丽丽,戴克胜.线粒体对血小板膜蛋白GPIbα酶切的调控作用[J].中国实验血液学杂志,2020,28(05):1704-1709.

基金:国家自然科学基金(81770117);江苏省科教强卫工程-临床医学中心资助项目(YXZXA2016002).