1、3D打印技术介绍

3D生物打印是一种先利用医学图形数据构建三维数字模型，然后按照对三维模型的分层和精确定位来分配含有活细胞的生物墨水打造具有生化功能的组织或者器官的制造技术。这项基于离散堆积原理的分层制造、逐层堆砌的打印技术，能够打印出可以模仿人体复杂解剖结构和生化功能的组织，可以根据设计制造出传统方法无法完成的生理结构，在组织工程中应用广泛。通过打印不同组织、器官的活细胞并添加各种生物活性材料的“BIOINK”，能够彻底改变3D结构的生物、化学和机械特性，达到增强组织、器官最优功能化的技术[1]。

与传统组织工程及其他几种先打印支架成型后再接种细胞构建组织的打印方式相比，3D生物打印将不同类型的细胞精确印刷在相应的空间位置，根据不同组织/器官特性添加相适应的生物材料后形成类似组织/器官的强度和弹性并产生一定的生物学功能。该技术通过从时空上操纵细胞成三维（3D）组织样结构，获得更高的细胞密度，实现构建的组织内外部细胞密度分布均匀，在形成支架的同时让支架内部含有细胞，实现细胞的空间受控分布，实现在宏观、微观尺度上结构和功能的精确控制，促进细胞—材料的相互作用，使得功能活性组织与器官的体外再造成为可能。该技术还能以干细胞和满足细胞繁殖的生物材料打印出仿生结构，再对干细胞进行定向诱导和分化生长，以培育出结构复杂且具有生理功能的组织。

基于上述优势，3D生物打印在组织工程上的主要应用前景是打印出具有生物活性、生理功能完整的人造组织器官用于移植，有效解决器官供不应求的问题以及异体组织器官移植存在的免疫排斥反应。

目前可用的3D生物打印技术主要有以下几种类型：喷墨式打印、阀印刷、微萃取等，每种方法都有自身的优势和局限性。

喷墨打印采用液体生物油墨印刷后即成胶，该技术通过加压使得液体生物墨水从打印头喷射出来立即凝结成胶状从而构建3D构造体。其优点是能实现最高的细节（分辨率）印刷，能打印单个细胞，但不能打印细胞浓度高的生物油墨，因为细胞会聚集并阻塞打印头。

阀印刷是根据计算机模型中构造体的三维空间分布来控制阀门的开关打印喷嘴来实现生物墨水沉积。其特点是分辨率比喷墨打印低，但可以打印浓度范围更大的生物油墨。

微萃取由打印机使用压力挤出凝胶生物油墨，由于增加了打印喷嘴直径，这种打印可以处理最高的细胞浓度，但分辨率最低。大多数商业生物烧结使用这项技术，因为它是最便宜和最常用的生物打印方法。

2、3D生物打印技术在组织工程中的应用

3D生物打印含有活细胞的组织/器官类似物，在组织工程领域显示出巨大的潜力，已有较广泛的研究。目前，3D生物打印技术已经能够打印生物结构简单、功能单一、血管和神经分布简单的微观组织；对于生物结构复杂，需要复杂血管和神经联系实现细胞和基质信息传递的宏观器官的打印技术，仍处于探索研发阶段，要实现移植和临床应用还有很长的一段路要走。2019年12月25日，《中国医学计算机成像杂志》报道了以色列特拉维夫大学采用3D生物打印技术以病人自体的组织和细胞为原料打印出第一个完整心脏的重大医学突破，表明3D生物打印技术在制备供人体移植的组织/器官方面，有无可比拟的前景和潜力。

2.1 类似骨组织植入物

在骨科应用方面，3D生物打印技术以患者DICOM为依据，在计算机CAD辅助技术下构建数字模型打印出“量身定制”的个体化植入物或假体，保证了植入物或假体在解剖学形态上与患者残余骨结构达到良好适配，最大限度地恢复关节功能[2]。3D打印技术制备的骨组织工程支架在机械强度、孔隙调节、空间结构复杂性等方面均具有独特的优势[3]。LIANG等人[4]为35例髋部周围肿瘤患者进行肿瘤切除并3D打印个体化假体臵进行置换，术后随访证明3D打印的假体髋关节功能良好、性能稳定。Zhang等人[5]通过3D打印制备出仿生半月板植入人体软骨损伤部位体现出良好的功能性替代。

2.2 皮肤

目前，3D生物打印技术能够构建具有生物功能的类似皮肤组织并向着可用于人体移植的方向发展。Lee等人[6]使用3D喷墨打印技术创建了一个皮肤组织结构模拟皮肤组织真皮和表皮的多层结构，培养后发现角化细胞正常分化形成多层表皮角质层。Koch等人[7]通过激光辅助细胞印刷技术制造皮肤类似物，体外培养观察到基底膜和细胞间连接的形成；采用裸小鼠背侧皮肤移植测试证明打印的皮肤与宿主组织的整合。

2.3 心脏瓣膜

3D生物打印技术的个性定制化精准打印能够满足心脏瓣膜在生物力学和生化功能上的要求。Lueders等人[8]利用天然聚合物和活体干细胞打印出了具有良好生物功能特性的心脏瓣膜。Hockaday等人[9]应用聚合物打印出具有复杂解剖结构和异质性的工程主动脉瓣，该瓣膜形状保真。这些研究都证明3D生物打印技术创建多细胞组织阀门有实现临床使用的可能性。

2.4 神经

Hsieh等人[10]利用聚氨酯水凝胶包裹打印神经干细胞，实验表明该细胞不仅保持良好的体外增殖与分化能力，更在斑马鱼神经损伤体内模型中表现出神经修复功能。这说明3D生物打印技术具备构建用于可移植神经细胞的可能。

2.5 肝脏

供体的缺乏及免疫排斥限制了肝脏移植的临床应用，而3D生物打印技术在肝组织工程中体现出巨大潜力。游辅宇研究提出，3D生物打印技术具备在微观及宏观多尺度构建组织的能力，是连接不同尺度组织工程的桥梁。目前3D生物打印技术不仅可以通过喷墨打印技术用于构建微观尺度肝组织，还可以微挤压技术构建宏观尺度肝组织，并且在规模构架肝组织基本功能单元的基础上以基本单元为模块进行仿生组装，从而实现微观和宏观尺度的肝组织衔接，最终有望实现打印出能够进行人体移植的肝组织[11]。2017年，Kizawa等人采用3D打印技术成功制造出迷你版的具有生物活性的人类肝脏组织，能代谢药物、葡萄糖以及脂质，分泌胆酸，其功能可以维持数周。2017年JEON等人[12]利用微挤3D生物打印技术构建的肝组织块细胞数量可达到1×107个/mL水平，接近体内组织细胞数量级水平。

2.6 肺泡

美国的一些大学已经开发出一种水凝胶可以形成模仿血管的通道。当红细胞被泵出时通过这些通道能够获得氧气，这项研究有望进一步研制出能够模仿人体肺泡功能的仿生组织[13]，见图1（照片来源于：https：//post.parliament.uk/research-briefings/post-pn-0620/）。

图13D生物打印的水凝胶肺泡结构

2.7 卵巢

美国西北大学的研究人员已经打印出能够维持卵泡的明胶结构，当移植到绝育小鼠的体内时，这些人造的卵巢可以发育血管和卵泡并且自然成熟。人工植入的卵巢够使受精卵在母体内发育到足月出生，母鼠也能哺乳，并表现出正常的激素功能[14]。

2.8 角膜（基质）

纽卡斯尔大学的研究人员采用微挤压印刷技术打印了角膜的一部分（透明的前面眼区）。他们创造了胶原蛋白和包含人类角膜细胞的海藻酸生物墨水，并打印成一个定制的角膜模具，然后把模具去除后留下透明的角膜组织[15]。

3、3D生物打印在组织工程中面临的技术难题和挑战

人体组织器官的3D生物打印技术相对传统的医疗手段具有巨大的潜力和优势，既可解决供体器官供不应求的问题，又可有效避免异体免疫排斥反应。3D生物打印总体目标研究的目的是打印出供再生医学使用的人造组织和器官，目前该技术已经能够打印出生理功能与结构简单、血管和神经关联性要求不高的组织/器官（例如功能完整的心脏），但由于技术限制（主要是移植初期的血管化难题无法与宿主循环系统快速对接、仿生效果不佳）还不能进行人体移植。目前该技术在构建能够用于移植的复杂组织/器官方面还处于研究和探索阶段，如何实现构建的组织内细胞间的相互信号传导以及血管和神经网络的覆盖与嵌入，以实现最终打印功能化器官，仍有很长的一段路要走，真正实现这一目标还面临很多挑战和技术难题，主要包括以下7个方面。

3.1 组织异质性

组织和器官由各种不同类型的细胞组成，目前3D生物打印技术普遍采用先隔离后打印不同类型细胞的打印策略，要确保活体细胞占据在解剖学上的对应位置并保持生物活性能够增繁、发育成完整组织，充分发挥生物学功能作用仍然是一个挑战。目前3D生物打印技术在技术方面无法达到分辨率、打印速度、细胞存活率的要求，也无法保证细胞与聚合物在打印过程中的生物相容性和融合度，特别是具有复杂结构的规模化宏观组织的打印。

3.2 血管化难题

血液供应几乎是所有组织的一个关键特征。目前3D生物打印技术在组织工程中的最大难题是血管化的延迟，进行移植的组织必须依靠复杂的血管网络维持组织活性（获得营养、氧气和物质循环），然而重新创建这个血液供应网络是困难的。要实现血管网络从移植剖面吻合处生长并穿透移植物，这一过程需要数月才能完成，这期间移植物中部通常由于缺乏血管而坏死并导致炎症反应。以往促进血管化的方法有对生物材料进行化学改性、调整孔隙大小以促进血管长入，加入血管生长因子促进血管生长等，但是血管的自然长入需要较长的时间，不能满足移植初期组织对血供的需求[16]。因此，预先设置血管网络实现移植组织与宿主血液循环系统的快速对接以满足移植初期的供血要求是移植成功的关键。目前，基于3D生物打印技术能够构建精准、可控的微流通道结构的优势为组织工程血管化问题的解决开辟了新的途径，基本思路是将活性生物材料和血管种子细胞为墨水打印血管样组织，使得预先构建血管网络成为可能。Yu等人[17]将水凝胶与细胞结合成纤维细胞打印出了血管样组织，为进一步的血管化研究奠定了基础。尽管目前的研究有望打印出血管网络以保证组织移植初期的血管化问题，但是尚存在一些瓶颈：现有技术条件下只能打印直径较大的血管且无法实现血管细胞的分化和增殖以构建完整的毛细血管生长进入移植组织内部现成血管网络。实验表明，在血管周围200µm～300µm范围内的组织能够获得营养供应等物质信息交换，超过这个范围外的组织则得不到供血，严重限制了打印组织的体积、规模以及存活率。

3.3 组织和器官排斥

目前组织缺损修复的方法有自体移植与异体移植，但自体可供移植的组织来源有限，会对患者造成二次损伤；异体移植存在排斥反应，且可能存在病原体传染的风险。以生物材料为墨水进行3D生物打印构建的组织进行移植往往引发来自病人的免疫排斥反应，特别是遇见构造体包含异体（往往是捐赠者）细胞的情况下。使用含有细胞的生物墨水打印时，使用自体细胞或供体的细胞（同种异体细胞）利与弊难以权衡。采用自体细胞的优点是低免疫排斥风险，但如果病人有遗传疾病，他们的细胞可能需要进行基因编辑修复后才能使用。此外，当细胞来自一个病人个体时，提取打印一个组织或器官所需要大量细胞的来源是困难的。使用异体基因细胞可以克服这一点，大型标准化批量生产的细胞可以预先准备好并储存在细胞库中，在需要时提取，细胞可以被大量生产以至于可以用来治疗几个病人。其缺点是，由于这些细胞来自于一个异体（捐赠者），病人往往发生排斥反应，即使移植成功仍然需要服用药物来处理免疫排斥的风险（可能持续一生）。

3.4 缺乏理想的生物墨水

用于3D生物打印的生物墨水主要由两种材料构成：一是活体细胞，二是满足生物活性的聚合物。作为生物墨水的材料不仅要考虑活体细胞和聚合物的生物相容性、聚合物的降解性和机械性能，还要考虑是否适于工业批量生产。

3.4.1 活体细胞

活体细胞构成“生物墨”的基础成分，不同的活细胞用于打印不同的组织和器官。活体细胞主要来源于自体和异体，从患者自体身上能够提取的细胞来源有限，还需要考虑患者本身是否存在基因的缺陷，并且会对患者造成二次损伤；从异体提取的细胞存在排斥反应，且可能存在病原体传染的风险。

3.4.2 聚合物

只有完全满足细胞生存要求的聚合物才能用做生物墨水的原料。由于细胞对生存环境的要求非常苛刻，这就要求用于生物墨水的聚合物在物化性质上既能保持一定的温度和湿度，又能保持良好的生物相容性，无毒无害，易降解，降解产物无毒且能被生物完全吸收。聚合物不仅要求能够促进活体细胞黏附以保证细胞在聚合物构造体表面和内部的存活与增殖，又要在力学和物理结构上能够维持细胞基质的活性、物化状态的稳定和组织液的流动。所以，适于3D生物打印聚合物材料非常有限。目前研究实验多采用水凝胶材料来构造3D组织结构。

综上，不论是活体细胞还是聚合物，目前还没有专门用于细胞打印的理想的“生物墨”。

3.5 仿生效果不佳

目前的3D生物打印技术只能构建出结构简单、功能单一的组织，对于生理功能与结构复杂的器官尚无法构建，特别是器官与结缔组织、细胞基质、微血管、神经、淋巴管等信息循环系统、通道的衔接与吻合成为组织工程的瓶颈。功能复杂、器官不同功能和类型的细胞之间、细胞与基质之间，依靠神经和血管网络传递信息以实现完整的功能表现，而细胞分化增殖形成神经和血管网络需要一定周期，往往导致组织功能障碍；打印的组织/器官在体外培育过程中形成的血管和神经网络，无法短时间增殖生长渗透进入宿主血管神经网络并在短时间内形成循环通道，这就导致植入组织/器官无法获得营养供应和物质排泄而坏死。

3.6 缺乏合理及标准化的构建策略

3D打印技术在打印过程中，打印时间的延长将降低细胞的存活率，因此对于复杂的组织/器官往往需要采取模块化组装策略，在快速打印保证细胞较高存活率的基础上，构建微观基本单元进行模块化组装。组织的构建需要在打印时间、打印分辨率和细胞存活率3个方面达到标准才可能为构建宏观、复杂的组织/器官提供足够可用的微模块。目前3D生物打印技术不仅在技术方面无法达到分辨率、打印速度、细胞存活率的要求，并且规模化构建策略过于单一，对于复杂生理结构和功能的组织/器官的打印尚无合理标准化的构建策略。

3.7 打印出的移植组织不能适应婴幼儿患者身体生长的要求

根据婴幼儿患者量身定制的生物打印组织存在一定的空间结构，植入后不能随着患者生理的成长而改变空间结构。梁娅男等人[18]的研究披露了多例打印气管移植的案例，随访后进行的测试表明植入器官出现再上皮化、纤毛上皮细胞形成和恢复机械强度，此后受体肺功能恢复正常。这些研究证明了3D生物打印技术构建的通道、支架为打印用于移植的同种异体气管、主动脉或空肠移植物等组织工程领域的研究提供了新的思路。但是作者也表示儿童患者的身高会随着成长而增加，移植物不能生长可能会阻碍患者的成长，在最坏的情况下，由于不能满足成长中患者的需求，移植可能会失败。这一案例尽管只是组织工程在临床应用中的个案，但也反映出移植组织不能适应婴幼儿患者身体生长的问题。

4、3D生物打印技术在组织工程中的前沿研究及展望

尽管要实现构建出功能完整的活体细胞用于人体移植还有很多技术难题需要突破，该研究领域也处于初级阶段，但目前多国科研人员为了该技术早日实现临床和移植目的研究层出不穷，取得了一些突破性的进展和全新思路，主要集中在以下6个方面。

(1）研发能够解决组织异质性和仿生结构难题的理想打印技术。随着打印原料生物和聚合物成分的复杂程度和打印时间的延长可能严重影响细胞的存活率和生物活性功能，因此新的打印技术需要在打印速度和墨水的兼容性方面有所提高，能够在高分辨率前提下以人体组织细胞浓度的生物墨水为原料进行精准构建，并且能够增加生物材料创建更复杂的、能够用于临床应用的复合组织/器官结构。目前，各国科学家已经开始研发新的打印技术以满足3D生物打印在组织工程中应用的要求。例如：活性喷射打印技术，由纽卡斯尔大学研发，通过多阀喷头来喷射2个不同液态的生物墨水的技术，可以实现2种生物墨水在半空中发生碰撞和反应形成凝胶，然后落在印刷基板上。该技术允许快速打印带有细胞的凝胶生物油墨，并且油墨中的细胞浓度接近人体中的组织[19]；悬浮层加法制造技术由哈德斯菲尔德大学和伯明翰大学研发，它使用微挤压打印机和具有支撑性的凝胶打印精致的3D结构，一旦打印物凝固，凝胶就可以被冲走，留下被打印的结构完好无损[20]。

(2）解决微细血管网络和神经、淋巴等微生物循环网络的构建。目前，解决血管化难题以及其他循环通道的基本思路是打印组织/器官过程中预先设置血管、神经可以实现移植组织/器官与宿主血管和神经网络的快速对接。较早的策略是先用絮凝材料构建三维的网状结构，当周围结构构建完成后去除絮凝材料得到三维的管网空隙为组织提供灌注[21]。目前，在植入物血管化和循环通道难题方面的研究有了突破性进展。一种尝试方法是将内皮细胞植入移植物通道壁性结构以加速新血管的形成，WALLES等人[22]将自体内皮细胞植入脱细胞猪空肠血管网中生成血管化组织工程气管；提供血管生成因子，如重组人促红细胞生成素、血管内皮生长因子。另外一种是采用脱细胞支架中含有促进血管生成的碱性成纤维细胞生长因子[23]，这类方法的思路是改变血管的物化性质和结构来促进血管快速生长。还有学者提出在打印技血管基础上构建微血管的思路，Lee等人[24]提出了一个打印血管的方法学，首先创建更大的血管通道（0.5mm～1.0mm），然后通过自然成熟过程创建相邻毛细管网，在模型中，微血管床被建立在2个大流体血管之间，并通过发芽方式生成小血管连接到来自大通道边缘的血管分支。Ozler等人[25]通过计算机成像技术，获得仿生人主动脉参数，并采用大鼠胚胎干细胞为生物墨水，混合有小鼠胚胎干细胞的水凝胶生物材料即可产生仿生主动脉，结果提示支架材料可以促进细胞的融合。

(3）通过自体干细胞的培育解决打印组织和器官的移植排斥问题。在打印大规模组织时，从一个患者身上提取打印一个组织或器官所需要大量细胞是困难的，而使用异体基因细胞又面临排斥反应的风险和需要长期服用药物。生物墨水中的种子细胞是决定组织功能的基石，目前用于打印的原生活细胞有成骨祖细胞、软骨细胞、纤维细胞、角质细胞、肝细胞、血管内皮细胞、心脏瓣膜间质细胞及平滑肌细胞、心肌祖细胞等自身已分化细胞和组织干细胞，这些细胞有着各自的特点与缺陷；干细胞因具有分化为不同特定功能细胞的特性，是近年来最受关注的细胞来源之一。特别是诱导多功能干细胞能够从患者组织中获取细胞，经过重新编程获得，解决了来源的限制；且由于与患者细胞同源，不存在免疫排斥的问题。目前有研究证明从自体身上提取干细胞进行诱导分化培育出不同组织/器官的可能性，黄达等人[26]在研究中提出自体提取的干细胞来源广泛，培养简单，无排斥反应，利用可搭载干细胞并提供良好生长环境的生物材料，通过3D打印技术可以快速、精准地制备出具有生理功能的血管、神经、骨骼等复杂组织结构：采用皮肤干细胞与生物材料混合为原料可以打印出满足生物力学要求的人造血管。Hu等人[27]以小鼠脂肪干细胞并加入FGF2因子为原料通过3D光固化打印制备出仿生神经修复的效果与自体移植相似。Shi等人[28]利用微流体系统，在打印水凝胶的同时加入脂肪间充质干细胞，培养24天后发现能够产生软骨和成骨生长因子，并且使用该系统可以调节软骨细胞和成骨细胞以及分化。上述研究表明生物3D打印干细胞技术能够促进3D生物打印技术从单一材料向多种材料复合的方向发展，为解决移植过程中的排异性问题提供了非常有价值的思路和解决方案。

(4）研发出满足生物活性和规模化培育的新型生物墨水。目前，各国科研机构对于满足印刷适应性与交叉连接能力、流变特性与机械性能、生物相容性与聚合机制、细胞毒性与降解可控性的理想化生物墨水和生物材料正在研发当中。Singh等人[29]开发出无交联式明胶生物油墨（Cross-Linker-FreeSilk-GelatinBioink），将之应用于软骨组织工程，检测后三维结构显示出极佳的膨胀性能、降解性能和抗压强度，并且支持包括软骨细胞及其外基质的生长和增殖，表现出较好的生物相容性。随着生物材料、高分子化学、纳米等技术的突破，理想的生物墨水将会被研发出来。

(5）研发出标准化、可行的宏观和微观结合的组装构建策略。目前组织工程领域中构建宏观组织的策略是模块化组装，这种策略的基本方法为先快速打印出组织器官的基本功能/结构的微观单元，在经过一段时间的培育后实现活体细胞依附打印结构上并适应结构而显现活性生物功能后，让细胞激活自我组装、增殖生长的生物特性后进一步成熟，在对构造组织的生物活性和医用价值进行精准的临床评估，在确定临床应用的价值后，再对这些基本微观单元进行仿生组装，从而得到兼具微观与宏观结构功能的组织。尽管目前研究尚未建立模块化组装的标准化策略和基本规则，但根据最新研究，模块化组装策略成为组织工程应用中搭建宏观和微观之间的桥梁，为打印复杂组织/器官提供了全新的构建策略。YANGAGI等人[30]提出了一种利用3D生物打印技术先打印肝芽样细胞球再组装为宏观肝组织的方法。目前，连接微观与宏观构建肝组织的文献报道较少，但游辅宇、高毅等认为3D生物打印技术相较于传统组织工程技术，具备连接微观组织和宏观器官之间功能和结构并实现血管、神经和附属功能的可能性。

(6）打印出的组织具备完全的生物活性和自我修复增殖功能。目前尚未有研究论证婴幼儿患者植入的组织/器官能够实现自我增殖和生长的可能性，但3D生物打印技术培育的组织/器官在经过一段时间的培育后可以激活细胞自我组装、增殖生长的生物特性，有望在进一步的研究中能够解决婴幼儿患者移植器官的生长问题。

5、结语

3D生物打印技术在组织工程中的应用尚属一个非常新的领域，各种研究处于初级阶段，真正实现3D打印出能够用于人类移植和临床应用的组织/器官还有很长的路要走，并面临诸多挑战。3D生物打印技术，机遇与挑战并存。随着对生物材料、微生物技术、生命科学和打印技术研究的不断深入和突破，有望利用3D生物打印技术构建具有功能活性的组织器官。总之，该技术未来在医学组织工程方面的应用前景极为广阔，将制造出能够供人体移植的组织/器官以修复或者替换人类受损或者衰老的器官，解决人类器官移植来源的难题而极大提高人的生命质量和人类医疗健康能力。

参考文献：

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