非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)能够引起家猪高热、皮肤发绀、内脏及淋巴结出血、呼吸困难、喜卧嗜睡等症状，最后导致急性死亡，病死率可达到100%。亚急性ASFV感染不会使猪群发生急性死亡，但致死率仍有30%～70%。慢性ASFV可以使少数猪感染，感染后活下来的猪终生带毒的概率为10%[1]。ASFV是一种大型双链DNA病毒，由病毒核心、核壳、内膜、衣壳及外包膜组成，全长170～190 kb。ASFV不同分离株的基因组长度不同，其包含的开放阅读框(open reading frame, ORF)数量也不同(160～175个),因此基因编码的蛋白质种类也不同，其中大约125个保守的ORF编码超过50种功能蛋白[2-3]。当前仍有超过一半的ASFV基因功能未知，成为制约疫苗研发的因素之一。目前，已经确定一些ASFV蛋白质具有免疫原性，但其抗原表位未知，免疫保护反应不确定，仅能刺激机体产生体液免疫，开发有效的非洲猪瘟(ASF)蛋白疫苗难度很大[4]。而减毒活疫苗能够保持较为完整的免疫抗原，同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，是研究ASF疫苗的主要方向。通过基因工程技术敲除单个或多个不同基因可以研究相应基因的功能及各基因之间的相互作用[5],为开发非洲猪瘟蛋白疫苗、基因缺失减毒疫苗、核酸疫苗及载体疫苗提供研究基础。本文对近年来通过基因缺失手段研究ASFV基因功能的相关文献进行了综述，以期为ASF防控技术开发提供参考。

1、免疫调节基因的敲除

1.1 炎症小体抑制基因的敲除

H240R基因编码的pH240R蛋白是一种能与p72蛋白相互作用的衣壳蛋白[6]。H240R基因不仅靶向核转录因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号转导，还阻断了NLRP3炎症小体的激活。NF-κB必需调节剂(NF-κB essential modulator, NEMO)是NF-κB 抑制子激酶家族[inhibitor of nuclear factor-κB kinases, IKK]复合物抑制剂的一种成分，pH240R蛋白与NEMO相互作用，随后降低了NF-κB抑制因子α(inhibitor of NF-κB, IκBα) 和p65蛋白的磷酸化水平；同时，pH240R蛋白与NLRP3结合抑制NLRP3炎症小体的激活，使得白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)分泌减少[7]。缺失H240R基因的ASFV HLJ/18毒株，在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAM)上培养时病毒效价降低了1×102TCID50,病毒致病力降低，而且其在体内或体外都能诱导产生更多的IL-1β[8],进而增强宿主的抗病毒炎症反应[6]。说明H240R基因能通过抑制信号转导降低炎症因子表达量，使ASFV在宿主体内增殖并引起严重的临床症状。

1.2 干扰素抑制基因的敲除

1.2.1 EP402R基因

EP402R基因编码的CD2蛋白是一种病毒外膜糖蛋白，是T淋巴细胞黏附分子CD2[9]的同源物，它的存在能够使被病毒感染的PAM周围形成典型玫瑰花环状结构。CD2蛋白通过与CD58分子相互作用激活NF-κB信号通路，从而诱导猪淋巴细胞或巨噬细胞中干扰素(IFN)信号转导或凋亡[10],逃避宿主的免疫调节[11]。P. L. Monteagudo等[12]敲除BA71毒株的EP402R基因构建BA71-ΔCD2毒株，发现其与亲本株在非洲绿猴SV40转化的肾细胞(COS-1)中的生长曲线几乎一致，但毒力大幅降低，接种BA71-ΔCD2毒株的猪并不出现ASF典型临床症状及病毒血症，血液中能检测到大量ASFV特异性抗体，并诱导T淋巴细胞活化，同时用BA71-ΔCD2毒株免疫的猪不仅对亲本BA71毒株的攻毒具有抵抗能力，而且对异源基因Ⅰ型毒株E75、基因Ⅱ型毒株Georgia 2007/1的攻毒也具有抵抗能力。说明EP402R是ASFV的毒力基因，它的存在抑制了宿主的免疫机能，使病毒能够逃避宿主的免疫反应。

1.2.2 A137R基因

A137R基因是病毒复制的非必需基因，其编码的pA137R蛋白通过自噬介导TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1 ,TBK1)溶酶体降解，对环化鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激分子(cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes, cGas-STING)介导的IFN-β信号通路进行负调控，抑制了IFN-β或IFN靶向的反应元件的激活[13]。敲除A137R基因的ASFV-G-ΔA137R毒株在PAM上的生长显著变慢，以较低剂量接种该毒株的家猪除出现短暂的轻度体温升高外，没有其他ASF相关症状，血液中病毒效价也明显低于亲本组，对亲本株攻毒能够产生免疫保护[14]。说明A137R基因能够在一定程度上影响病毒毒力，并通过抑制IFN激活途径抑制宿主免疫系统功能。

1.2.3 I226R基因

I226R基因是一个保守基因，编码一种晚期蛋白，在人胚胎肾(HEK293T)细胞中过表达时能够抑制干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)激活，并导致NEMO蛋白降解，显著抑制NF-κB信号通路的激活[15],抑制了IFN和IL-1β的产生。与亲本相比，SY18-ΔI226R毒株接种于PAM后的复制明显减慢，接种家猪未出现明显的ASF症状，以中低剂量接种家猪能够抵抗亲本病毒攻击[16]。说明在宿主体内，I226R蛋白可能通过多种机制削弱抗病毒反应，以抵消病毒感染期间的先天免疫反应。

1.2.4 多基因家族(MGF)360-12L-14L基因

MGF360-12L-14L基因可阻断由cGAS-STING、TBK1、IKKβ过表达诱导的NF-κB活化。在IFN-β信号下游，MGF360-12L基因通过降低干扰素调节因子9(interferon regulatory factor 9,IRF9)的总蛋白水平来阻断干扰素刺激反应原件(interferon stimulated response element, ISRE)启动子的激活。此外，MGF360-12L蛋白可以抑制IFN-β介导的抗病毒作用[17]。MGF360-14L基因抑制cGAS-STING信号诱导的IFN-β表达，下调IRF3蛋白表达，并通过泛素介导的蛋白水解促进其降解，说明这3个基因共同通过抑制IFN-Ⅰ的产生进行免疫逃避[18]。

1.2.5 MGF110-L7L-L11L基因

ASFV MGF110家族的L7L-L11L基因包括L7L、L8L、L9R、L10L和L11L 5个基因，编码的产物作用未知[19],当前在病毒中并没有检测到这5种基因共同表达的蛋白质。L10L基因与基因组左端的KP177R基因(编码p22蛋白)同源；L11L基因缺失不会影响Malawi Lil-20毒株在家猪体内的毒力[20]。敲除这几个基因构建的SY18-ΔL7-11毒株与亲本的体外复制动力学相似，接种家猪后只有部分猪出现轻微短暂发烧，并且SY18-ΔL7-11毒株能够诱导机体产生IFN-γ,而亲本毒株不能[21],表明这段基因的存在抑制了IFN-γ的产生，可能是单基因或多基因共同对宿主细胞产生了免疫抑制。

1.3 与JAK-STAT途径相互作用基因的敲除

ASFV MGF505-7R基因可以增强ASFV的致病力[22],通过与IRF9相互作用抑制干扰素刺激基因因子3(interferon stimulated gene factor, ISGF3)异源三聚体的形成，并抑制ISGF3介导的ISRE启动子的激活[23]。除此之外，MGF-505-7R基因还通过上调E3泛素连接酶RNF125的表达和抑制Hes5蛋白的表达来促进Janus活化激酶(Janus kinase, JAK)的降解[24],从而抑制IFN-β介导的Janus活化激酶-信号转导和转录激活(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription, JAK-STAT)途径。以GZ201801为亲本构建的ASFV-ΔMGF505-7R毒株恢复了STAT2和STAT1的磷酸化能力，减轻了对ISGF3核转位的抑制，并增加了对IFN-β的易感性[23]。MGF505-7R基因编码多种蛋白质，通过与JAK-STAT途径关键元件的特异性相互作用抑制IL-1β和IFN-Ⅰ的产生，操纵和逃避宿主抗病毒反应。

2、病毒复制相关基因的敲除

2.1 胸苷激酶(thymidine kinase, TK)基因

TK基因能够编码ASFV在PAM复制过程中所需要的多种酶，通过水平介导脱氧核苷三磷酸的合成影响病毒在宿主细胞中的复制。敲除TK基因的ASFV在仓鼠和猴细胞中仍然正常生长，说明对于不同的ASFV分离株，基因相同发挥的作用也不完全相同[25]。以ASFV-G/VP30(Georgia 2010的Vero细胞适应株)为亲本构建的ASFV-G/VP-ΔTK毒株在PAM中的复制能力下降，接种低剂量和高剂量ASFV-G/VP-ΔTK毒株的家猪均不出现明显临床症状，也不能抵抗亲本攻毒[26]。说明TK基因仅是一个复制必需基因，对于ASFV毒力并没有影响。

2.2 E165R基因

E165R基因编码ASFV复制所必需的dUTP焦磷酸酶(dUTPase),这种酶高度保守并具有高度特异性，参与DNA的修复并防止尿嘧啶被并入DNA。在ASFV-G上敲除E165R基因构建的ASFV-G-ΔE165R毒株在PAM上培养时的复制效率与亲本相同，而BA71-ΔE165R毒株在PAM上培养时复制效率比BA71毒株下降90%[27],这种差异是由于亲本毒株不同所致。同时，接种较低剂量ASFV-G-ΔE165R毒株的家猪表现出与亲本毒株攻毒几乎一致的ASF临床症状[28]。说明E165R基因并不是ASFV-G毒株的毒力基因，而其在ASFV复制过程中发挥的作用很可能由其他基因替代。

2.3 EP153R基因

在宿主体内，当细胞被感染后会启动细胞凋亡程序引起被感染的细胞死亡，同时达到清除病毒的目的。EP153R基因编码的C型凝集素蛋白(C-type lectin protein)是一种非必需蛋白，能够调节Ⅰ类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)抗原提呈及抑制细胞凋亡[29],参与病毒感染细胞诱导的红细胞吸附。以BA71V毒株为亲本构建缺失株BA71V-ΔEP153R,发现与亲本相比细胞中胱天蛋白酶-3(Caspase-3)表达水平和细胞死亡数均增加[30]。说明EP153R基因通过抑制被感染细胞凋亡使得病毒能够在细胞内复制并扩大感染。

3、其他单基因的敲除

ASFV中还有很多基因的确切功能没有被了解，只能通过构建的基因敲除毒株特性及免疫保护评价效果来初步判定其是复制相关基因还是毒力相关基因，在筛选时通常会倾向于靠近MGF家族的基因，如H108R、E111R、I8L、I177L和I73R基因等。

H108R基因编码的蛋白质定位于病毒颗粒的内囊，在病毒复制晚期表达，其功能与痘病毒中存在的其他小跨膜蛋白(如I5L蛋白)一致，与病毒复制和毒力的增强有关。ASFV-G-ΔH108R毒株感染PAM后虽然病毒产量与亲本毒株相近，但在某些时间点复制水平显著降低。虽然ASFV-G-ΔH108R毒株具有残余毒力，但接种后存活动物产生了强烈的ASFV特异性抗体反应，动物可以抵抗亲本病毒的攻击[31]。

E111R基因是ASFV的一个早期表达基因，当前对其的研究还不够深入，敲除该基因的重组病毒与亲本(ASFV-SY18)毒株在体外的复制动力学相似，高剂量接种家猪表现与亲本毒株相似的ASF症状，低剂量接种表现为ASF症状延迟[32]。

I8L基因是一个保守的早期表达基因，研究人员发现ASFV-G-ΔI8L毒株与亲本毒株在PAM中的复制动力学相似，低剂量接种后与亲本毒株感染症状难以区分[33]。

I177L基因表达一种晚期蛋白，表达量明显低于p72蛋白。敲除ASFV-G的I177L基因构建的ASFV-G-ΔI177L毒株体外复制能力明显降低，以低剂量或高剂量(1×102～1×106HAD50)接种动物都表现低病毒血症现象，免疫猪在28 d内都没有临床症状并产生强烈的特异性抗体反应，对亲本毒株攻毒能提供有效保护[34-35]。

I73R基因编码的早期表达蛋白pI73R是一种含有Zα结构域的核酸结合蛋白，它定位于细胞核中，通过抑制细胞核中信使RNA(mRNA)的输出来广泛抑制宿主蛋白(包括抗病毒蛋白)的合成，促进病毒复制。但基因缺失突变体ASFV-GZΔI73R完全无致病性，可有效保护猪免受野生型ASFV的侵害。I73R基因对ASFV的发病机制至关重要，具有良好的生物安全性和免疫原性，是病毒衰减的潜在靶标[36]。

综上所述，H108R、I177L、I73R基因是ASFV的毒力基因，但不是复制的必需基因和免疫保护位点。E111R基因只影响ASFV一小部分毒力，也不是病毒复制的必需基因。I8L不是毒力基因也不影响病毒复制。

4、多基因的联合敲除

4.1 与EP402R基因的联合敲除

4.1.1 EP402R与DP96R基因

DP96R基因是一个毒力相关基因，编码p15蛋白，在非洲和欧洲流行的ASFV中高度保守，不影响病毒的体外复制[37]。DP96R基因通过抑制cGAS-STING、TBKⅠ和IKKβ来负调控IFN-Ⅰ表达和NF-κB信号转导[38],在病毒免疫逃避中起着重要作用。敲除EP402R和DP96R基因后，SY18毒株在PAM上培养展现出与亲本毒株相似的生长曲线，但失去了红细胞吸附特性，以中等剂量接种家猪并没有出现ASF症状，无病毒血症，在血液中检测到ASFV抗体，并对亲本攻毒产生免疫保护[39]。说明DP96R基因是ASFV的毒力基因之一，与EP402R基因共同抑制宿主的免疫反应。

4.1.2 EP402R与EP153R、MGF360-12L-14L基因

以GZ201801 WT为亲本毒株构建的EP402R与EP153R双基因缺失株并不会影响病毒的体外复制，但病毒毒力明显减弱[29]。在双基因缺失株基础上继续敲除MGF360-12L-14L基因构建了五基因缺失株ASFV-ΔECM3,结果其体外复制能力与亲本毒株相似，接种后猪无明显ASF症状，产生特异性ASFV抗体[40]。因此，EP402R与MGF360-12L-14L基因通过抑制IFN产生协同EP153R基因抑制感染细胞凋亡，逃避宿主免疫反应。

4.1.3 EP402R与I177L、MGF360-12L-14L基因

I177L基因在病毒复制的晚期转录，是一个毒力基因，影响病毒的体外复制能力[34],其诱导免疫逃避的机制还不清楚。以GZ201801毒株为亲本毒株，敲除EP402R、I177L和MGF360-12L-14L构建五基因缺失株，用缺失株接种后家猪无明显ASF症状，血液中检测不到病毒DNA,且家猪能抵抗亲本攻击，血液中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor, TNF- α)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ水平明显升高，产生ASFV抗体的时间短且抗体水平高[41],表明ASFV的毒力由几种基因共同决定。

4.2 与MGF基因的联合敲除

根据MGF蛋白大小将其分为MGF100、MGF110、MGF300、MGF360和MGF505[42]。MGF蛋白在宿主细胞被病毒感染过程中的多个阶段包括转录和翻译过程发挥重要作用。同时MGF蛋白还影响ASFV的毒力和免疫逃逸等功能[43]。基因Ⅰ型ASFV自然分离株OUR T88/3、NH/P68和中国分离株SD/DY-I/21、HeN/ZZ-P1/21缺失了MGF110-11L、MGF110-12L、MGF360-6L、MGF360-10L、MGF360-11L、MGF505-1R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L和MGF505-2R这10个基因，并截短了MGF360-9L、MGF505-3R、EP153R、EP402R和MGF100-2L这5个基因，使得它们在猪体内均表现出低致病力和慢性持续性感染[44]。

HLJ/18毒株经过连续传代获得的适应性ASFV毒株可以在HEK293T和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中有效复制。与野毒株相比，其在PAM中的传染性降低，并在传代过程中逐渐积累了MGF300(1L、2R和4L)和MGF360(8L、9L、10L和11L)基因的缺失[45],表明这几个基因对ASFV早期适应HEK293T细胞具有重要作用。ASFV-G感染Vero细胞并传代110代后获得的适应株ASGV-G/V可保持高水平复制，但其在PAM中的复制能力为亲本毒株的百万分之一到十万分之一。研究人员通过测序发现适应株EP424R、CP430R、MGF505-10R、I177L、MGF360-18R等基因发生突变，并缺失了基因MGF505-11L、MGF100-1L、I7L、I8L、I9R、I10L的完整序列[46],表明这些基因与ASFV在PAM中的复制相关。Arm07毒株感染新型永生化猪肾细胞(immortalized porcine kidney macrophages, IPKM)并传代20代后可观察到MGF300-4L、MGF360-8L、MGF360-9L、MGF360-10L、MGF360-11L、MGF505-1R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF505-2R和MGF505-3R基因的缺失，与亲本毒株相比其在IPKM和PAM中的复制效率没有变化，但对动物的毒力显著降低[47]。表明MGF基因家族的这些基因不影响ASFV的复制或者其发挥的功能可替代，但对ASFV的毒力有影响。

4.2.1 MGF110-9L与MGF505-7R基因

MGF110-9L与MGF505-7R基因是两种干扰素抑制剂，MGF-110家族的表达可能影响病毒的宿主范围与病毒毒力，其基因产物在病毒合成内质网的过程中发挥作用。MGF110-9L基因是MGF-110家族的一员，它高度保守，并在复制早期转录影响ASFV在PAM中的体外复制。Li D.等[48]用以CN/GS/2018毒株为骨架构建的ASFV-Δ9L毒株接种家猪，在观察期间2只死亡，其余3只表现出低病毒效价和低排毒现象并产生特异性ASFV抗体，说明MGF110-9L基因影响ASFV的毒力。进一步研究发现，ASFV-Δ9L毒株诱导自噬介导的TANK 结合激酶1(TBK1)降解，使其产生的TBK1含量明显低于亲本毒株。而在体外试验中TBK1过表达能够抑制ASFV的复制，说明MGF110-9L基因通过对抗IFN-Ⅰ的产生抑制宿主的免疫反应[49]。Ding M. Y.等[50]构建的ASFV-Δ110-9L/505-7R双基因缺失毒株复制能力和毒力均下降，高剂量接种动物后能检测到较强的特异性抗体，能对亲本的攻毒产生保护作用。说明MGF110-9L与MGF505-7R基因在功能上有所重合，都能够通过影响TBK1的含量抑制促炎因子IFN-Ⅰ介导的JAK-STAT信号转导。

4.2.2 MGF110-5L-6L与I177L基因

以ASFV-G毒株为亲本毒株构建的ASFV-G-ΔMGF110-5L-6L毒株在PAM培养中与亲代毒株复制能力相似，并在接种后使家猪产生与接种亲代毒株后类似的症状，同时动物在感染过程中产生强抗体反应，表明MGF110-5L-6L基因并不是病毒复制的必需基因，也不是毒力基因。然而，当同时缺失MGF110-5L-6L及I177L基因时，用ASFV-G-ΔI177L/MGF110-5L-6L毒株接种的家猪比用ASFV-G-ΔI177L毒株接种的家猪对亲本毒株攻毒的抵抗能力更低[51]。说明MGF110-5L-6L基因虽不参与产生病毒毒力，但可以辅助相关毒力基因发挥致病作用。

4.2.3 MGF505-7R与H240R基因

PAM感染ASFV导致IL-1β和IFN-Ⅰ表达水平降低，MGF家族的MGF505-7R基因主要发挥抑制IL-1β和IFN-Ⅰ信号通路的作用[52]。以毒株HLJ/18为亲本毒株构建的ASFV-ΔH240R-Δ7R毒株在PAM中的病毒效价是亲本毒株的1/10,接种猪可产生特异性ASFV抗体，能够对亲本毒株攻毒产生免疫保护[53]。说明MGF505-7R和H240R基因的联合缺失从信号通路的途径清除了ASFV对IFN-Ⅰ、IL-1β的抑制，阻止了病毒的免疫逃避。

5、展望

ASFV是一种结构复杂的大型双链DNA病毒，编码160多个基因，其中大多数基因的作用仍然未知，只能通过功能基因组学进行预测。基因编码的蛋白质参与病毒复制、病毒装配、病毒抵御机体免疫应答等，只有逐渐认识各种基因编码蛋白的功能、相互作用及病毒与宿主的相互作用，才有利于研究ASF防控技术。基因敲除是研究ASFV基因功能的有效手段之一，对缺失不同基因构建的重组毒株体外复制能力进行评价，对其感染细胞后各种信号通路激活过程介导因子表达情况进行检测，以及其编码的蛋白质、细胞因子的变化水平进行监测，同时开展体内感染试验，研究重组病毒对猪的致病力，以及其在体内的带毒与排毒规律、参与致病的过程，比较其与亲本的差异，从而揭示该基因的作用。在基因缺失减毒活疫苗的开发方面，单个基因的敲除通常不能作为理想的降低ASFV致病力的方式，而联合多个基因的敲除则往往可能导致病毒体内的复制能力和保护效果降低，比如EP402R基因的缺失并不影响病毒的毒力，但是缺失后能够显著减轻病毒血症的发生[54]。敲除MGF基因会减少病毒在巨噬细胞中的复制，降低ASFV的毒力，但病毒血症持续时间延长，并且缺失的MGF家族基因可以通过自突变和同源重组轻松恢复其毒力[55]。通过遗传操作手段敲除强毒株中毒力相关基因是构建理想减毒ASFV的有效方法，但要注意其残余毒力对动物的影响[56],因此一方面要通过多个毒力基因的组合缺失大幅度降低ASFV的致病力，另一方面接种动物后要能够诱导有效的免疫应答，同时还需要保持病毒在体外的高效复制特性。在ASF流行的情况下，在基因缺失疫苗株中加入区分野毒感染与疫苗保护动物的标记以区分疫苗接种猪与自然感染猪也是十分必要的[57]。相信随着生物技术的发展，通过研究人员的共同努力，一定能增进人们对ASFV的认识和理解，制定出更为有效的防控措施。

文章来源:关雪,赵启祖,邹兴启,等.基于基因敲除技术的非洲猪瘟病毒基因功能的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2024,(21):93-99.