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研究猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株GDjm的全基因组测序与遗传进化

2020-06-11 642 上传者：管理员

摘要：为监测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因变异情况,对广东地区某猪场患有猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)仔猪的肺脏样品进行检测及病毒分离,在猪肺泡巨噬细胞(PAM)上成功分离1株病毒并命名为GDjm株,然而分离的毒株不能感染Marc-145细胞。全基因组进化分析、同源性比对及重组分析结果显示,GDjm属于重组毒株,与GDZS2016的同源性为96.2%,与中国高致病性毒株HUN4同源性为96.0%,与美洲型经典毒株VR-2332的同源性为87.4%,与NADC30同源性为82%,与欧洲型毒株Lelystad-virus同源性为57.9%。NSP2序列比对和同源性分析结果显示,GDjm与高致病性毒株HUN4、JXA1、JXwn06相似,在511、534～562位存在氨基酸缺失。GP5序列比对以及同源性分析结果显示,GDjm毒株在GP5抗原表位存在氨基酸突变。经重组分析得出GDjm株为高致病性毒株HUN4与华南地区流行毒株GDZS2016的重组毒株,重组区域为6723～9521bp、11998～15019bp。

关键词：
兽医学
分离鉴定
毒株
猪繁殖与呼吸综合征病毒
遗传进化
重组
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猪繁殖与呼吸综合征可引起任何品种、性别、年龄的猪发病,其中易感性最高的是母猪和仔猪,且感染后出现严重的临床症状[1]。PRRS是导致母猪发热、厌食、早产、流产、死胎、弱仔等繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为主要特征的传染病[2]。目前猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分为2个基因型:基因型1和基因型2,代表性毒株分别为欧洲型LelystadVirus和美洲型VR-2332[3]。中国内陆于1995年首次发现PRRSV,并在1996年成功分离出第1株PRRSV毒株CH-1a[4];2006年,中国南方地区出现由变异性毒株引起的高发病率和高死亡率的疫情[5,6],随后蔓延至全国大部分地区,给我国养猪业造成了严重的经济损失。

PRRSV为单股正链RNA有囊膜病毒,基因全长约为15～15.5kb[7],至少含有10个开放阅读框(ORF),包括ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7[8]。在ORF1a中的NSP2基因最容易变异,主要含3个区域:N末端的半胱氨酸酶区、中部的高变区和C末端疏水的转膜区,NSP2发生的变异主要位于中部的高变区[9]。NSP2区域在许多PRRSV分离毒株中存在氨基酸缺失,这是PRRSV基因组长度差异的一个主要原因。ORF5编码的糖基化囊膜蛋白GP5有较强的免疫原性,可诱导机体产生中和抗体,常被作为构建PRRSV诊断的重要靶标[10]。GDZS2016为近年来广东地区流行毒株,与JXA1毒株在同一分支,相关文章报道其能造成临床发病率为90%,死亡率为10%,不具有感染Marc-145细胞的能力,但可感染PAM细胞[11]。PRRSV发生基因重组的频率很高,可能导致新型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的出现[12,13]。

2018年7月,本实验室从广东省江门市某PRRS发病猪场采集肺脏组织样本,PCR检测结果为PRRSV阳性,在Marc-145细胞上无法分离纯化,最终在原代猪肺泡巨噬细胞上成功分离,将其命名为GDjm株。对全基因组进行测定,将测序结果与其他代表PRRSV毒株进行序列比对和进化树分析,进而分析GDjm毒株与国内流行的PRRSV毒株的相似性和重组情况,为深入研究该病毒株的遗传与变异奠定了基础。

1、材料与方法

1.1病料

肺脏病变组织来源于广东省江门市疑似发生PRRS某养殖场,-20℃冻存备用。

1.2细胞、菌体

Marc-145细胞、PAM细胞、大肠杆菌感受态细胞,由华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心种猪疾病防控实验室保存。

1.3主要试剂

病毒DNA/RNA提取试剂、反转录试剂盒以及胶回收试剂盒盒购自Promega公司;RT-PCR相关试剂盒购自Vazyme公司;DNAMarkerDL2000等购自广州东盛生物科技有限公司;EB替代染料(GoldviewⅠ)购自广州华奇盛生物科技有限公司;pEASY-BluntSimpleCloningVector购自北京全式金生物技术有限公司。大肠杆菌感受态细胞购自天根生物科技(北京)有限公司。

1.4引物的设计与合成

根据GenBank中发布的PRRSV毒株全基因组序列进行生物信息学分析,选取保守区域设计14对特异性引物(表1)用于扩增序列,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5病料处理

取1g肺脏组织剪碎,加入1mLPBS在冰上充分研磨。将研磨液倒入洁净的1.5mL离心管中,12000r/min离心3min,收集上清后在超净工作台中用0.22μm微孔过滤器过滤,取200μL滤液用于病毒核酸提取,并通过PCR进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)检测,其余滤液置于-80℃保存备用。

1.6病毒分离

采用PAM细胞和Marc-145细胞从样品中分离PRRSV。将处理好的临床样品感染PAM和Marc-145细胞,盲传3代,并观察细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)。收毒后反复冻融3次,每代取200μL细胞培养液于无RNA酶的离心管中,用于提取核酸和PCR检测。

表1扩增全基因序列引物

1.7间接免疫荧光试验(IFA)

将PAM细胞和Marc-145接至24孔细胞培养板中,置于细胞培养箱中培养24h后弃掉培养液,PBS缓冲液洗涤3次。每孔接种10μL上述滤过液,设立空白对照,放在于细胞培养箱中孵育1h后弃掉液体,PBS轻轻冲洗3次,各孔加入500μL含有2%FBS的细胞维持液,观察培养2～5d后弃掉培养液,PBS洗涤3次,各孔加进200μL固定液于-20℃固定20min,弃掉液体,PBS洗涤3次;然后各孔加入200μL0.5%TritonX-100室温穿膜10min,弃掉液体后PBS洗涤3次;加入200μL的1∶400倍稀释的一抗(鼠源抗N蛋白单抗),置于37℃孵育1h,期间每20min轻轻摇晃1次,确保充分吸附,弃去液体后PBS洗涤5次;避光加入200μL稀释后的荧光二抗(FITC标记的羊抗鼠IgG),37℃条件下避光作用1h,PBS洗涤5次,置于荧光显微镜下进行观察。

1.8提取核酸及反转录

将收集的上清液取200μL,采用Promega公司提供的试剂盒进行病毒核酸提取和反转录,反转录产物置于-20℃冰箱保存。

1.9目的基因分段扩增

采用TAKARA公司提供的高保真酶对目的片段进行扩增,PCR扩增体系为50μL,PrimeSTARMaxPremix(2×)0.5μL、5×PrimeSTARBuffer10μL、dNTPMixture4μL、RNase-freeH2O27.5μL、cDNA模版4μL,上下游引物各2μL。PCR扩增程序:98℃预变性1min;98℃变性10s,53℃退火15s,72℃延伸2min,30个循环;72℃再延伸10min。取6μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.10基因克隆、测序

PCR扩增产物经过电泳鉴定后,使用Promega公司提供的胶回收试剂盒进行胶回收。取4μL胶回收产物1μLpEASY-BluntSimpleCloningVector25℃连接25min,转化后挑菌鉴定,将阳性菌液送往生物公司测序。

1.11序列分析

表2所示PRRSV代表毒株基因序列均来自GenBank。运用Lasergene与Mega5.0软件将测序毒株与国内外代表毒株进行序列比对和进化树构建,并将GDjm毒株NSP2与GP5基因氨基酸序列与国内外代表毒株进行比对分析。通过SimPlot软件对GDjm株进行全基因重组分析。

表2PRRSV参考毒株信息

2、结果与分析

2.1病料的RT-PCR检测

使用ORF5基因检测引物对样品进行扩增,1%琼脂糖凝胶电泳分析结果表明(图1),检测结果与预期结果(864bp)相符。

图1PRRSVORF5基因片段扩增电泳结果

2.2病毒分离与IFA

在Marc-145细胞多次接毒后未出现CPE,随后将处理后的病料分别接种于Marc-145细胞与PAM细胞,培养48h后进行间接免疫荧光检测N蛋白。如图2所示,Marc-145细胞无荧光,PAM细胞上有明显的荧光信号,证明分离毒可感染PAM细胞但不感染Marc-145细胞。

图2间接免疫荧光检测结果

2.3PRRSVGDjm全基因组测定

使用14对相互重叠的特异性引物扩增全基因。琼脂糖凝胶电泳分析显示,扩增的14个产物大小与预期一致(图3)。将扩增片段胶回收连接载体后测序,使用SeqMan软件拼接序列,获得全基因序列全长为15249bp,命名为GDjm株。

图3PRRSVGDjm全基因RT-PCR扩增琼脂糖凝胶电泳

2.4PRRSVGDjm基因进化树构建与同源性分析

应用DNAStar软件对GDjm毒株与国内外代表性毒株进行全基因组进化树构建,结果如图4所示。遗传进化树分为欧洲型代表毒株Lelystadvirus和美洲型代表毒株VR-2332两大分支,以VR-2332为代表的美洲型又可进一步分为以JXA1、JXwn06为代表的高致病毒株分支,以我国CH-1a与VR-2332为代表的低致病性毒株分支,以及美国NADC30为代表的分支和近年来出现的QYYZ为代表的分支。如图所示,GDjm株与华南地区近年新出现的重组毒GDZS2016同源性最高,并位于JXA1、JXwn06等为代表的高致病性毒株和以CH-1a为代表的经典毒株中间。故判定GDjm株可能为重组毒株。

利用DNAStar软件对PRRSV全基因核苷酸序列分析,结果如图5所示,GDjm与GDZS2016、HUN4、NVDC-CQ4-2012、WUH4、JXA1的同源性分别为96.2%、96.0%、95.7%,95.5%、95.4%,与NADC30同源性为82%,与美洲型代表毒株VR2332同源性为87.4%,与欧洲型代表株Lelystadvirus同源性仅为57.9%。

图4PRRSV全基因组的进化树分析

●标注毒株为所测毒株

图5PRRSV-GDjm全基因序列比对结果

2.5GDjmNSP2与GP5氨基酸序列比对及核苷酸同源性分析

运用DANStar对GDjm和国内代表典毒株进行NSP2氨基酸序列比对,结果如图6所示,GDjm毒株在511、534～562位存在30个不连续氨基酸的缺失,此外在531位存在T531I突变。

运用DNAStar软件对GDjm和国内外参考毒株进行GP5氨基酸序列比对(图7)。GDjm在29位有A29V变异;在185位有V185A突变;在189位有I189L突变;在39位有1个L39I突变。此外GDjm还存在多个突变位点,在34位存在D34G突变,58位有N58E突变,107位有V107A突变,196位有Q196R突变。

图6PRRSV-GDjmNSP2氨基酸序列比对结果

方框中为核苷酸变异位点,下同

图7PRRSVGDjmGP5氨基酸序列比对结果

2.6PRRSV全基因重组部位特征分析

运用SimPlot软件将GDjm株与高致病性毒株HUN4和近年来华南地区毒株GDZS2016进行全基因组重组分析。经分析得出(图8):GDjm株为高致病毒株HUN4与GDZS2016进行重组的重组毒株。重组区域分别为6723～9521bp、11998～15019bp。

图8PRRSVGDjm毒株重组分析

坐标尺:200bp;区分度:20bp

3、讨论

PRRS是全球养猪业的重大传染病之一。我国分离得到的毒株以北美型PRRSV为主。防控PRRS的疫苗主要有经典毒株和高致病性毒株减毒活疫苗以及灭活疫苗[14]。我国PRRSV流行的种类众多,研发和生产疫苗的厂家众多,毒株的选用以及生产方式皆有不同,导致使用混乱。养殖场也可能在免疫流程中使用不同型号的疫苗,使毒株间发生遗传重组的可能性增加,加上RNA病毒复制酶低保真性和自身免疫系统的影响[15],进而加速PRRSV变异。

本试验对广东省江门市疑似发生PRRS的猪场采集病料进行PCR检测,结果呈阳性;通过对GDjm毒株全基因组测序,并对其与其他PRRSV毒株同源性进行比较和构建进化树分析。全基因组分析中GDjm与GDZS2016同源性最高,为96.2%。NSP2是PRRSV最大的非结构蛋白,容易发生缺失和突变,基因长度约为2.9kb。GDjm毒株NSP2氨基酸序列比对结果与高致病性毒株HUN4、JXA1、JXwn06和高致病疫苗株JXA1-P80相似,在511、534～562位存在30个不连续氨基酸的缺失,符合高致病性毒株特点。美洲型毒株GP5蛋白的表位有3个,aa27～aa30和aa180～aa197为非中和表位,aa37～aa45为中和表位[16]。与美洲型代表毒株VR-2332相比,GDjm在非中和表位中有1个A29V的变异;在185位有V185A突变,该突变与高致病性毒株及其疫苗株相同;在189位有I189L突变,该突变与经典毒株和高致病性毒株及其疫苗株相同。中和表位中,在39位有1个L39I突变,该突变与高致病性毒株及其疫苗株相同。

GDZS2016株是华南地区2016年出现的重组毒株,相关文章报道其能造成临床发病率为90%,死亡率为10%,现研究表明该毒株只能感染PAM细胞,对Marc-145不具有感染性[17]。HUN4毒株是高致病毒株,临床试验表明其能造成发病率和死亡率高达100%,均能使Mare-145和PAM感染[18]。全基因重组部位特征分析表明HUN4与GDZS2016重组,重组区域8558～9462bp、11995～12982bp。这2个片段编码病毒RNA复制酶、聚合酶GP2、GP3、GP4、GP5[19],它们的重组可能与GDjm毒株不能感染Marc-145细胞相关。综上所述,GDjm毒株为HUN4与GDZS2016的重组毒株,具有致病性增强的潜在风险,加大了广东地区PRRSV防控的难度,因此有必要开发新型疫苗预防疾病的发生,并早日解决PRRSV感染与流行的问题。

参考文献：

[10]张涵,解长占,张世亨,等.PRRSVYN-LQ株的全基因序列测定及遗传进化分析[J].中国兽医学报,2018,38(7):1272-1275.

[16]于林洋,董建国,张乐宜,等.猪繁殖与呼吸系统综合征病毒华南株GDgz的分离鉴定及遗传进化分析[J].广东农业科学,2017,44(4):138-145.

张驰,董建国,于林洋,王爽云,范兰兰,张乐宜,刘燕玲,王磊,宋长绪.猪繁殖与呼吸综合征病毒华南株GDjm全基因组测序与遗传进化分析[J].畜牧与兽医,2020,52(06):81-88.

基金:国家重点研发计划(2018YFD0501102);“十二五”农村领域国家科技计划项目(2015BAD12B02-5);2018年乡村振兴战略专项(构建现代农业体系)重大动物疫病防控技术研究和推广项目;广东省重点领域研发计划项目:非洲猪瘟应急综合防控技术研究及应用(2019B020211003);广东省畜禽地方品种保护与研发利用提升工程.