禽流感病毒属于正黏病毒科的A型流感病毒属,主要在家禽及野生鸟类中传播。高致病性禽流感不仅对家禽养殖业造成了巨大的经济损失,而且对人类和动物健康也构成了持续性威胁。禽流感病毒亚型众多,变异速度快,能够持续不断地跨种间传播感染人类,目前感染人类的禽流感病毒亚型已超过10多种,如H5N1、H7N9和H9N2这些具有重要公共卫生学意义的亚型。截止至2018年底,WHO已报道860例人高致病性H5N1禽流感病毒确诊病例[1]。在同一时间范围内,数百万家禽因感染H5N1AIV而被扑杀或死亡,造成了相当大的经济损失[2]。禽流感病毒的基因组由8个独立的负链RNA片段组成,它们编码至少17种质(PB1、PB2和PA)、非结构蛋白质(NS1)和核输出蛋白(NEP/NS2)[3];7种辅助蛋白包括PB1-F2、PB1-N40、PA-X、PA-N155、PA-N182、M42和NS3蛋白。

PB1-F2蛋白是2001年被发现的第1个辅助蛋白,是由PB1基因的第2个阅读框编码的一种非结构蛋白[4,5]。除了翻译模式外,PB1-F2还有几个独特的特点[6]:在感染细胞中快速降解、线粒体定位、形成非选择性离子通道[7,8,9],以及促凋亡特性[10]。PB1-F2除了诱导免疫细胞凋亡以外,诸多研究表明它可引起多种效应,与病毒的致病力密切相关,如上调病毒聚合酶活性,诱导炎症反应而导致继发细菌性肺炎,抑制干扰素反应等[11,12]。PB1-F2的线粒体靶向序列位于其羧基端,该区域为富含两亲性的α-螺旋精氨酸序列,而63-75位氨基酸被证明是PB1-F2定位于线粒体所必需的。

在AIV感染过程中,能刺激宿主产生针对结构蛋白(HA、NA、NP、NS2、M1和M2)和非结构蛋白(NS1)的抗体,只有针对HA的抗体能有效中和病毒[3]。抗PB1-F2蛋白的抗体是针对A型流感病毒感染产生的特异性抗体,通过免疫沉淀和免疫荧光试验已经证实可以在免疫小鼠和人类恢复期血清中检测到PB1-F2特异性抗体[13]。近年来有研究表明,针对PB1-F2C末端的特异性抗体可有效保护小鼠免受AIV感染,而针对PB1-F2N末端蛋白的特异性抗体对病毒感染无显著作用[10]。

本研究旨在采用原核表达系统表达并纯化cPB1-F2羧基末端蛋白,并结合杂交瘤技术制备H5N1禽流感病毒cPB1-F2特异性单克隆抗体,为进一步明确抗PB1-F2特异性抗体在AIV感染中的生物学功能,以及为禽流感病毒抗体药物研发和致病机制研究积累资料。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系、菌株及质粒

人肺癌细胞A549、大肠埃希菌DH5α及Rosetta(BL21)感受态、pGBKT7-PB1(H5N1)、pCAGGS-cPB1-F2(38-87aa)等,均由吉林大学动物医学学院人兽共患病研究所病毒实验室保存。

1.1.2主要试剂

胎牛血清、胰酶、RPMI1640及DMEM培养基,Hyclone公司产品;T4DNA连接酶、DNAMarker、限制性内切酶、TMB试剂、AlexaFluor488荧光标记的抗体和抗体亚类鉴定试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒及ECL化学发光试剂盒,Thermo公司产品;PEG融合剂、50×HAT培养基、50×HT培养基,为Sigma公司产品;胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒,OMEGA公司产品;胰蛋白胨、酵母提取物和琼脂粉,青岛海博生物技术有限公司产品;Balb/c小鼠,购自长春市亿斯实验动物技术有限公司。

1.1.3仪器设备

PCR仪(K960型),杭州晶格科学仪器有限公司产品;凝胶图像分析仪(X-press型),法国VilberIourmat公司产品;稳压稳流电泳仪(DYY-6B型),北京市六一仪器厂产品;微量离心机(Pico-17型),美国Thermo公司产品;高压灭菌锅(HVE-50型),日本Hirayama公司产品;纯水机(UNIQUE-R20型),厦门锐思捷科学仪器有限公司产品;台式恒温振荡器(IS-RDD3型),美国精骐有限公司产品;电热恒温水槽(DK-8D型),上海一恒科学仪器有限公司产品;pH计(Starer2100/3CPro型),美国奥豪斯公司产品;显微镜(OIympusXI-71型),日本奥林巴斯公司产品;电热恒温培养箱,湖北省黄石市医疗器械厂产品;超低温冰箱,德国Heraus实验仪器公司产品;超声波细胞破碎仪(HT-150型),山东济宁恒通有限公司产品。

1.2方法

1.2.1重组载体的构建

参考GenBank中的AIVPB1-F2(H5N1)基因序列(序列号FJ864691.1),设计上、下游引物(表1),以pGBKT7-PB1(H5N1)质粒为模板进行PCR扩增,反应程序为:95℃预变性10min;95℃30s,58℃30s,72℃40s,35个循环;最后72℃延伸10min。纯化的PCR扩增产物与pGEX-6p-1载体用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后进行连接,转化大肠埃希菌DH5α,进行PCR鉴定和酶切鉴定,对阳性重组质粒pGEX-6p-1-cPB1-F2进行测序分析。

1.2.2蛋白的表达纯化及鉴定

将测序正确的重组质粒cPB1-F2转化至大肠埃希菌Rosetta(BL21)感受态细胞,接种于LB(Amp+)液体培养基,37℃培养过夜;将培养物转接培养至OD600值为0.6～0.8,以终浓度为0.5mmol/LIPTG;16℃诱导过夜;收集菌体超声破碎,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况与表达形式。采用GlutathioneSopharose4B凝胶亲和层析柱纯化重组蛋白后,用20mmol/L还原型谷胱甘肽室温洗脱目的蛋白;洗脱下来的cPB1-F2重组蛋白用超滤离心管进行浓缩,采用BCA蛋白定量试剂盒进行定量分析,置-80℃保存备用。

1.2.3动物免疫

以纯化的cPB1-F2重组蛋白为免疫原,按照每只100μg免疫6周龄～8周龄的Balb/c小鼠。将抗原与等体积佐剂混合乳化后背部皮下多点注射,阴性对照组注射等体积的生理盐水;共进行3次免疫接种,每次免疫接种间隔2周,3次免疫1周后采血,分离血清检测抗体效价,血清分装后置于-20℃保存。3次免疫后2周腹腔注射加强免疫;首次免疫接种使用弗氏佐剂,以后免疫接种使用弗氏不完全佐剂。

表1PCR引物序列

1.2.4cPB1-F2重组蛋白间接ELISA方法的建立

利用方阵滴定法进行ELISA,确定抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度。重组蛋白cPB1-F2纯化后浓度为1.6mg/mL,用包被液对其进行1∶100、1∶200、1∶400、1∶800及1∶1600倍稀释,以确定最佳抗原稀释度;同时,将小鼠阳性血清进行倍比稀释,以未免疫小鼠血清作为阴性对照。按照P/N=阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值,求出P/N值。以阳性对照OD450nm读值最接近于1.0,且P/N大于2.1的抗原和血清稀释度作为最佳工作浓度。

1.2.5细胞融合、单克隆抗体的筛选及亚型鉴定

小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(2×107个)与加强免疫3d后小鼠脾细胞(2×108个)按照1∶10的比例融合,用含有1×HAT培养基连续培养10d～14d,融合14d后的杂交瘤细胞换成1×HT培养基培养,逐渐更换为无HT完全培养基。待融合细胞生长到孔底面积的1/5时,用间接ELISA试验进行阳性孔杂交瘤细胞筛选。选取OD450nm值较高的细胞孔通过有限稀释法进行3次～4次克隆纯化,直至细胞孔阳性率达100%。使用抗体亚类鉴定试剂盒对单克隆抗体亚型进行鉴定,取阳性细胞株上清作为一抗,分别以抗IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的抗体作为二抗,使用间接ELISA对获得的单克隆抗体进行亚类鉴定。

1.2.6间接ELISA鉴定单克隆抗体特异性

用纯化的cPB1-F2重组蛋白与GST蛋白(5ng/μL)分别包被酶标板。加入50μL待检融合细胞培养上清,37℃孵育1h,PBST洗板3次～5次,加入1∶1000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗(100μL/孔),37℃孵育45min后,PBST清洗3遍～5遍,加入100μL/孔TMB显色液,避光作用15min,加2mol/LH2SO450μL/孔终止反应,读取各检测孔OD450nm数值。

1.2.7Westernblot鉴定单克隆抗体特异性

将洗脱浓缩后的重组蛋白cPB1-F2与GST蛋白经处理后,进行SDS-PAGE电泳分离,并转至PVDF膜上;50mg/mL脱脂奶粉室温封闭2h,TBST洗涤3次后,用适量稀释的杂交瘤细胞上清4℃孵育过夜;TBST洗涤3次,用1∶5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗室温孵育2h,TBST清洗3次,用ECL发光试剂进行显色。

1.2.8IFA鉴定单克隆抗体特异性

将A549细胞接种至铺有爬片的24孔培养板中,待细胞长至70%～90%时,经PEI转染试剂转染pCAGGS-cPB1-F2质粒,4h～6h后换成含100mL/LFBS的DMEM完全培养基培养20h后,进行免疫荧光试验。以阳性孔杂交瘤细胞培养上清为一抗,4℃孵育过夜;以绿色荧光标记的AlexaFlour488抗体为二抗,37℃孵育1h;用Hoechst染细胞核5min后,在荧光显微镜下观察结果。

1.2.9单克隆抗体腹水的制备与纯化

取10周龄～12周龄的Balb/c雌鼠,每只腹腔注射500μL灭菌液体石蜡,7d后腹部注射阳性杂交瘤细胞0.5mL(1×106个/mL),7d～10d后小鼠腹部膨大明显时,立即无菌采集腹水。12000r/min离心10min,收集上清,利用ProteinG亲合层析柱进行纯化,分装后置于-80℃冻存备用。

2、结果

2.1cPB1-F2重组蛋白的原核表达及鉴定

将pGEX-6P-1-cPB1-F2重组质粒转化大肠埃希菌BL21菌,经0.5mmol/LIPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测结果显示,在分子质量约30ku附近出现特异性条带(图1),与预期表达产物分子质量相符,且重组蛋白以可溶性形式表达。

2.2阳性杂交瘤细胞ELISA筛选方法建立

以梯度稀释的cPB1-F2重组蛋白包被酶标板,加入倍比稀释的抗体进行矩阵试验,选择阳性血清OD450nm值约为1.0,且P/N值相对最大时对应的抗原、抗体稀释度为最佳稀释度。经筛选,抗原最佳稀释浓度为5μg/mL,阳性血清的最佳稀释倍数为1∶6000。最佳反应时间1h,最佳孵育温度为37℃,羊抗鼠IgG-HRP最佳稀释度为1∶1000时阳性孔OD值最接近于1。

图1SDS-PAGE检测cPB1-F2融合蛋白的表达与纯化

2.3免疫小鼠血清效价测定

采用已建立的间接ELISA方法测定免疫小鼠血清抗体效价。将纯化的cPB1-F2蛋白以5μg/mL包被96孔酶标板,将待测血清从1∶1600开始倍比稀释至1∶102400,结果显示,小鼠免疫后血清以1∶102400稀释时,P/N为9.545,仍大于2.1(表2);因此,血清抗体效价达到要求,可以进行融合。

2.4阳性细胞株筛选

当杂交瘤细胞铺满孔底面积的1/10至1/5时,将培养上清用间接ELISA法在cPB1-F2蛋白包被板上进行抗体检测,方法同免疫小鼠血清抗体效价测定。在至少进行了3次筛选后,将3次筛选均显示阳性的细胞株进行亚克隆及扩大培养定株。取1∶6000稀释的融合小鼠血清作为阳性对照,1∶2000稀释的空白小鼠血清作为阴性对照,PBS作为空白对照,进行间接ELISA检测。初步筛选出5株能稳定分泌抗H5N1cPB1-F2重组蛋白单抗的杂交瘤细胞,其P/N值均大于2.1。

2.5cPB1-F2单克隆抗体的特异性鉴定及亚型鉴定

将纯化的重组蛋白cPB1-F2与GST蛋白分别包被酶标板,依次加入获得的5株杂交瘤细胞培养上清,各孔OD450nm值以P/N>2.1为判定标准,用ELISA检测单克隆抗体与抗原的反应情况。鉴定结果显示有3株为cPB1-F2特异性抗体,且不与GST蛋白反应,分别为6F4、4D3和2C5(表3)。将杂交瘤细胞的培养上清进行亚型鉴定,结果显示3株均为IgG1型抗体。

2.6Westernblot检测单克隆抗体的特异性

将纯化的重组cPB1-F2(1-4泳道)和GST(5-8泳道)蛋白进行SDS-PAGE分离后,进行Westernblot检测。以获得的单克隆阳性杂交瘤细胞培养上清为一抗,HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗进行检测,并以GST蛋白作为阴性对照,结果显示,3株单克隆抗体均与cPB1-F2蛋白结合,在30ku左右出现特异性条带,而GST蛋白泳道未出现条带(图2)。

2.7免疫荧光法验证单克隆抗体的特异性

将pCAGGS-cPB1-F2质粒转染接种于24孔板的A549细胞,24h后进行IFA试验。分别以上述6F4、2C5和4D3杂交瘤细胞上清为一抗,二抗使用AlexaFluor488荧光标记的IgG抗体,结果显示,3株单克隆抗体均可结合cPB1-F2蛋白,产生较强的绿色荧光,而空白对照细胞无荧光(图3)。

表2小鼠血清抗体效价检测结果

表3ELISA鉴定cPB1-F2特异性的单克隆抗体

图2Westernblot鉴定cPB1-F2单克隆抗体的特异性

图3cPB1-F2单克隆抗体与cPB1-F2蛋白结合产生的特异性荧光

2.8腹水的制备及纯化

已经鉴定的杂交瘤细胞经小鼠腹腔制备腹水,收集的腹水采用ProteinG层析柱纯化,经纯化、透析的cPB1-F2单克隆抗体通过SDS-PAGE电泳检测,制备的腹水中含有大量MAb,且浓度很高,可以满足后续试验的需求。

3、讨论

PB1-F2是一种小分子质量的A型流感病毒蛋白[14],存在于多种流感病毒毒株中,其存在及表达水平的高低与AIV的毒力及致病性密切相关[6]。作为一个重要的毒力相关因子,PB1-F2具有多种重要的生物学功能,但其功能通常呈现出细胞及宿主类型的特异性,所以其分子作用机制较为复杂且目前尚未被阐明[15,16,17,18,19]。PB1-F2蛋白的C末端具有两亲性α-螺旋,能够相互作用,从而产生寡聚体。其C末端通过结合线粒体内膜蛋白ANT3和外膜蛋白VDAC1,引起线粒体通透性增强和膜电位下降,最终导致细胞凋亡[5]。近年来研究证实PB1-F2在感染AIV的小鼠和人体中表达的数量足够引起抗体反应,而且其C末端特异性抗体在病毒感染中的生物学意义尚需深入探索[10]。

本研究构建了表达H5N1流感病毒PB1-F2的羧基末端的重组载体pGEX-6p-1-cPB1-F2,诱导目的蛋白表达并以纯化的cPB1-F2重组蛋白为免疫原免疫Balb/c小鼠后细胞进行融合,按常规杂交瘤细胞筛选技术制备阳性杂交瘤细胞株。由于以cPB1-F2重组蛋白作为了免疫原,进行间接ELISA筛选试验时,将纯化的重组蛋白cPB1-F2和GST蛋白分别包被酶标板,以GST蛋白做抗原进行平行筛选,选取cPB1-F2重组蛋白OD450nm值阳性,且GST蛋白OD450nm值为阴性的即为抗cPB1-F2的单克隆抗体。经此方法保证筛选到针对cPB1-F2的特异性单克隆抗体。

本研究经间接ELISA试验筛选获得3株单克隆特异性细胞株,分别为2C5、4D3和6F4株,通过Westernblot,证实抗体均能识别结合cPB1-F2重组蛋白,而且表明本研究制备的cPB1-F2蛋白具有较强的免疫原性和抗原性;进一步用间接免疫荧光试验分析抗体的特异性,结果表明3株单克隆抗体均能与A549细胞表达的cPB1-F2蛋白产生特异性反应,显示特异性荧光,表明获得的PB1-F2单克隆抗体特异性和反应性较强。综上所述,本研究成功制备了特异性识别H5N1流感病毒蛋白PB1-F2C末端肽段的小鼠单克隆抗体,为流感病毒感染的预防与病毒致病机制的研究积累了材料。

参考文献：

[11]黄金凤.枯草芽孢杆菌作为细菌活载体递呈HA蛋白和PB1-F2蛋白及其免疫效果的研究[D].江苏南京:南京农业大学,2017.

[12]颜文娟.甲型流感PB1-F2分子特征及与人IFITM3基因关联性的研究[D].江苏南京:东南大学医学院,2017.

[14]于洪敏.A型流感病毒PB1-F2与p58IPK相互作用及对PKR信号通路的调控[D].吉林长春:吉林大学动物医学学院,2017.

徐国双,刘恩华,张茂林,段铭,关振宏.H5N1禽流感病毒PB1-F2特异性单克隆抗体的制备与鉴定[J].动物医学进展,2020,41(07):1-6.

基金:吉林省科学技术厅自然科学基金项目(20160101214JC).