体表创伤及创伤后感染是兽医临床常见症状，无论是自然创伤还是术后切口都可能造成动物的持续疼痛，引起机体各系统发生防御反应[1,2]，严重的创伤感染甚至会引发脓毒症、休克、多器官功能障碍，严重影响预后[3,4]。动物机体发生创伤后，兽医进行有效的临床处理和干预可有效地缓解动物疼痛和避免继发感染，此时抗菌、镇痛药物的选择和应用就显得尤为重要。利多卡因是临床常用的一种酰胺类局部麻醉药，能够暂时阻断神经纤维的传导，使疼痛阈值升高从而缓解局部疼痛，具有良好的表面穿透力及扩散性，局部镇痛效果良好且持久，并且对组织无刺激安全范围大，在临床上被广泛用于减轻或解除各种疼痛[5,6,7]。恩诺沙星是第3代喹诺酮类药物，为动物专用药，具有抗菌谱广、杀菌活性强、毒副作用小、与其他抗菌药物无交叉耐药性等特点，可广泛应用于兽医临床中各种感染性疾病的防治[8,9]。目前，国内兽医临床上仅有盐酸利多卡因注射液、恩诺沙星注射液的单方制剂，尚未见有批准的兽药凝胶剂型产品可供动物体外使用[10]，本试验选择生物相容性好、吸收起效快、易于涂抹的外用凝胶剂型[11]，制成盐酸利多卡因恩诺沙星复方制剂，以充分发挥这2类药物的联合应用效果，初步开展了抗感染和镇痛效果试验，为该制剂的临床合理应用提供数据支撑。

1、材料

1.1 试剂

盐酸利多卡因原料药（含量为99.7%），购自山东诚汇双达药业有限公司；恩诺沙星原料药（含量为99.5%），购自浙江国邦药业有限公司；盐酸利多卡因对照品（含量为93.4%）、恩诺沙星对照品（含量为99.5%），均购自中国兽医药品监察所；乙腈（色谱纯），购自美国DIKMA公司；卡波姆940、氮酮、丙二醇、聚乙二醇400、三乙醇胺，均购自国药集团生化试剂有限公司；盐酸利多卡因恩诺沙星凝胶（2%盐酸利多卡因）由江苏中牧倍康药业有限公司研制；乳酸钠林格注射液500 mL，购自安徽双鹤药业有限责任公司；营养肉汤（NB）培养基、脑心浸液琼脂（BHIA）培养基，均购自美国BD Biosciences公司。

1.2 主要仪器

高速匀浆机（型号为FSH-2A），购自金坛市医疗仪器厂；高效液相色谱仪、LC-10ATvp双泵、SPD-10Avp可见-紫外检测器、CTO-10ASvp柱温箱，均购自日本岛津公司；N-2000色谱工作站，购自浙江智达公司；AS1201全自动进样器，购自大连依利特公司；BS224S、BP211D电子天平，均购自北京赛多利斯公司；BXY-250药物稳定性试验箱，购自上海博讯医疗设备厂。

1.3 试验动物

6只杭州本地自然创伤感染犬（患病部位分别为左侧腹股沟、肛周、左后肢踝关节、左侧腹、右耳道和右侧第4乳区），雌雄犬兼有，1～8岁，营养状况良好，在室温20～25℃的饲养室内，编号1～6，采食同一犬粮，不限饮水，饲养1个月，期间未进行被毛清洁。用于体外抗感染试验。

6只标准实验比格犬，雌雄犬兼有，1～8岁，体重（9±2)kg，营养健康状况良好，在室温20～25℃的饲养室内，采食同一犬粮，不限饮水，饲养1个月，期间未进行被毛清洁。对照组与试验组在年龄、性别及建模部位、面积等差异无显著性，具有可比性。用于体表创伤建模镇痛试验。

2、方法

2.1 复方利多卡因恩诺沙星凝胶的制备

2.1.1 处方的筛选

选择增稠性好、溶解度高的卡波姆940作为凝胶基质；盐酸利多卡因以水为溶媒，在水中极微溶解的恩诺沙星选用丙二醇和聚乙二醇400作为溶媒；加入具有稳定作用的乙二胺四乙酸二钠以提高稳定性，加入促进透皮吸收的氮酮以更好发挥疗效，最终确定处方见表1。

表1 复方利多卡因恩诺沙星凝胶处方 

2.1.2 制备方法以及稳定性试验

称取处方量的卡波姆940缓缓加入适量水中，边加边搅拌至均匀分散，密封静置，使其成凝胶基质；称取处方量的恩诺沙星加入到丙二醇中搅拌至溶解，加入聚乙二醇400，搅匀；称取处方量的乙二胺四乙酸二钠加入适量水中溶解，加入处方量的盐酸利多卡因，使其完全溶解；加入溶解好的恩诺沙星溶液、氮酮、卡波姆940凝胶基质，用均质机充分搅拌均匀；用三乙醇胺调节pH值在5.0～7.0，加纯化水至全量，搅拌均匀，测中间体，灌封即得复方凝胶。

按照《中国兽药典》[10]的相关指导原则开展药物制剂的稳定性试验研究：取供试品3批，分别在温度60℃、25℃相对湿度90%±5%、照度为（4 500±500)Lx的条件下放置10 d，于第5、10天取样，按《复方盐酸利多卡因凝胶剂质量标准（草案）》（以下简称“标准草案”）考察其性状、均匀度、含量及有关物质，其中高湿试验需称量试验前后供试品重量，若吸湿增重5%以上则在相对湿度75%±5%条件下同法进行试验，若吸湿增重5%以下则不再进行此项试验。开展加速稳定性试验：在温度（30±2）℃、相对湿度65%±5%的条件下放置6个月，在试验期间第1、2、3、6个月末分别取样1次，按标准草案检测性状、均匀度、含量及有关物质[10,11,12]。

2.2 复方凝胶对犬创伤感染的体外抗菌试验及对犬创伤的镇痛试验

2.2.1 对犬创伤的体外抗菌试验

分别采集6只自然患病犬的感染部位样本，接种在含4 mL NB液体培养基的采样管中，密封，置于4℃冷藏箱中保存。4 h内转送至微生物实验室，取原液、10倍稀释液和100倍稀释液分别涂布于BHI平板培养基上，37℃恒温培养24 h，观察并记录菌落总数。将接种的样本原液加入含预先梯度稀释复方凝胶的96孔板中，每孔100µL,37℃恒温培养18 h，观察并记录抑菌结果。

2.2.2 对犬创伤的镇痛试验

将6只标准实验比格犬随机分为2组，标记为对照组（1-1,1-2,1-3）和试验组（2-1,2-2,2-3）。用剃毛器在大腿内侧剃毛备皮，直径12 cm，取皮器进行皮肤创伤造模，直径8 cm，记录伤口和动物状态。观察两组犬的疼痛程度，30 min后用乳酸钠林格注射液清洗创口，并分别向对照组和试验组施用2 g利多卡因凝胶和2 g复方凝胶，给药与观察记录时间保持同步，同一操作人分别于给药后3、6、12、20 min、12、24 h和2～14 d记录伤口和动物状态，并分别于给药前20 min和给药后20 min做疼痛打分。

观察指标观察动物的毛发、体态、呼吸、流涎、震颤、痉挛、蜷卧、发声等行为表现和临床触诊反应，给予病犬创伤轻度、中度和重度疼痛表现的评价[13]，通过采取NRS疼痛评定方法进行评估，0～10分代表着不同程度的疼痛情况，无痛为0分，轻度疼痛为1～3分，中度疼痛为4～6分，重度疼痛为7～9分，剧痛为10分[14]。观察并对比2组实验犬接受治疗前后的疼痛变化情况，分数越高则表示疼痛越严重。

统计方法用SPSS V23.0软件对数据作组间t检验分析，显著性检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

3、试验结果

3.1 工艺研究试验结果

根据表1的处方制备3批复方凝胶产品，HPLC法测定样品中盐酸利多卡因和恩诺沙星的含量结果见表2，均符合《中国兽药典》通常规定的含量限度范围要求。 

表2 样品中盐酸利多卡因和恩诺沙星样品含量测定结果  

3.2 产品的稳定性考察

稳定性试验结果见表3。60℃的温度，25℃相对湿度90%±5%及4 500 Lx光照对产品质量均没有明显的影响。

加速稳定性试验结果，见表4（在此仅列出1批数据），产品在6个月的加速试验中，性状和外观均匀度几乎没有变化，所有指标均符合标准草案的规定，其余2批的试验结果也符合规定，本品质量稳定。  

表3 复方凝胶的影响因素试验结果   

表4 复方凝胶的加速稳定性试验结果  

3.3 犬创伤感染的体外抗菌试验

样品肉汤培养后的BHI平板菌落计数，见表5。说明患犬感染程度不一（其中4号犬与6号犬受感染程度严重），体外抑菌浓度测定（MIC）的结果见表6。当产品稀释到恩诺沙星含量为0.01%时，各样本结果仍为阴性，这表明本试验制备的复方利多卡因恩诺沙星凝胶体外抑菌效果显著。  

表5 自然创伤感染患犬的菌落数量   

表6 不同稀释浓度的抑菌结果 

3.4 犬创伤镇痛试验

进行体表创伤造模后，6只比格犬均出现创部肌肉紧张、震颤，呼吸加深，张望创部，发出尖叫声等疼痛表征。施用复方凝胶的试验组镇痛起效时间（3.67 min）较施用利多卡因凝胶的对照组（4.67 min）更快。2组比格犬在治疗前的疼痛评分差异无统计学意义，治疗后的疼痛评分见表7。试验组和对照组疼痛评分有显著差异（P=0.025），复方凝胶的镇痛效果明显优于利多卡因单方凝胶。试验组和对照组犬均未出现皮肤苍白、发红等异常情况。

表7 体表创伤造模实验犬的疼痛评分 

4、讨论

利多卡因是常用的局部麻醉药，我国兽药临床上仅有注射针剂获批可供使用，而人用药品领域已开发出乳膏剂、微乳剂、凝胶剂、微乳凝胶剂、喷膜剂、贴片剂、复方制剂等[15]，广泛应用了非侵入式药物递送系统的经皮给药方式，药物经毛细血管吸收进入体循环产生疗效，相较于口服、注射等给药方式具有避免肝脏首过效应、吸收不受胃肠影响、避免血药浓度过高等诸多优点[16]。国外兽医临床上，Robin M C等[17]将2%利多卡因凝胶应用于健康犬的眼局部角膜诱导麻醉，1 min即可实现角膜完全脱敏，并在（25.3±12.5)min内保持，角膜敏感度在（58.4±16.6)min内显著降低，提供了持续、深度和耐受性良好的角膜麻醉；Tomich L M等[18]针对特应性犬的皮内试验（IDT）施用5%利多卡因贴剂、5%利多卡因乳膏剂进行疼痛评分，发现利多卡因乳膏与皮内注射相关的疼痛评分降低幅度最大，可用作IDT期间的辅助镇痛剂，同时减少镇静剂的使用；Minto B W等[19]在犬的外科手术期间滴注局部麻醉药进行观察和组织病理学检查，结果显示利多卡因和布比卡因在手术创面局部应用是可行的，并且不影响皮肤愈合；法国Audevard公司的Ekyflogyl凝胶产品，每毫升含有醋酸泼尼松龙1.8 mg和盐酸利多卡因8.7 mg，可用于缓解马匹与局部肌肉骨骼疾病相关的疼痛和炎症[20]。

本研究在前期研发单方利多卡因凝胶的基础上，选择常见的喹诺酮类广谱抗菌药物恩诺沙星，开发出具有抗菌效果的局部镇痛复方凝胶制剂，产品的稳定性试验结果表明该方设计合理，所选用的凝胶基质、溶媒、稳定剂均为常用试剂，制备工艺简单，相关试验结果均符合国家关于新兽药制剂开发的要求。

对该复方凝胶制剂的抗菌和镇痛效果进行初步探究。体外抗菌试验发现，当恩诺沙星稀释到极低浓度仍显示阴性，说明该凝胶制剂抑菌杀菌作用良好，可考虑进一步降低处方中恩诺沙星的含量；考虑到不同部位创口的感染菌株存在多样性，本试验从自然感染患犬的不同部位采集样本，结果表明恩诺沙星在该复方凝胶制剂中保持了其广谱抗菌性，可继续开展动物临床试验来验证其抑菌效果，以及药效是否受外在环境及患病动物是否舔舐、剐蹭的影响。实验犬局部创伤造模的镇痛试验结果显示，复方凝胶治疗后试验组犬的总体疼痛改善情况及镇痛起效时间均优于对照组的单方利多卡因凝胶，利多卡因和恩诺沙星发挥了很好的抗菌镇痛协同作用。

目前兽药市场上常见的止痛药常以口服、注射方式给药，临床操作困难，本研究选择表面穿透力和扩散性强的局部麻醉药利多卡因，加入具有广谱抗菌效应的恩诺沙星，佐以凝胶外用涂抹，达到局部润滑、迅速吸收起效，可极大减少给药困难，提高给药成功率，以轻松方便的方式缓解患病动物的疼痛，填补我国兽医临床可用的局部表面麻醉剂的剂型空白，同时发现涂抹该品的试验组犬没有出现皮肤苍白或者发红等异常或过敏情况，用药安全性好，可考虑广泛应用于兽医临床治疗。

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基金资助:中牧集团研发项目(2019ZMYF01-1);泰州市双创项目[泰州人才办(2019)14号];

文章来源:何金艳,马保臣,吴秋萍等.1种复方利多卡因恩诺沙星凝胶临床初步应用[J].现代畜牧科技,2023(12):23-27.